| 研究課題/領域番号 |
20K21385
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| 研究機関 | 東京医科歯科大学 |
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研究代表者 |
黒柳 秀人 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 准教授 (30323702)
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| 研究期間 (年度) |
2020-07-30 – 2022-03-31
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| キーワード | 拡張型心筋症 / mRNA前駆体 / 選択的スプライシング / ノックインマウス |
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| 研究実績の概要 |
2020年度は、Rbm20ノックアウトマウスと患者型変異ノックインマウスの表現型解析を行い、いずれもTtn遺伝子の心筋特異的スプライシング制御が失われていることから機能欠損であることを見出した。一方で、ノックインマウスのみが、心機能の低下と心室腔の拡大、致死的な不整脈など、ヒトの患者と同様の重篤な症状を示すことを明らかにして論文に発表した。また、ノックインマウスにおける変異型RBM20が機能獲得変異と考えられることから、その細胞内局在を解析し、心筋細胞の細胞質に顆粒状の構造に存在していることを明らかにした。これらの研究成果は、作製したRbm20ノックインマウスが患者の拡張型心筋症の症状をよく再現する優れたモデル動物であることを示しており、病態発現機構の解明に向けた今後の研究の進展が期待される。
一方、Ttn mRNAについては、RBM20ノックアウトやノックインのヘテロ接合体でも中程度にスプライシング異常が見られたことから、RBM20のタンパク質の量に依存する標的エキソンと、半量でも十分制御可能な標的エキソンに分類されることが想定された。そこで、ノックアウトおよびノックインのホモ接合体およびヘテロ接合体におけるTtn mRNAの配列レパートリーを精度よく明らかにする必要性があり、そのための手段として全長Ttn mRNAを複数の断片に分けてRT-PCRにより増幅するための条件検討を行った。そして、予備実験としてノックインのヘテロ接合体から作製したライブラリについて、長リードシーケンサーによる配列解析を進めている。また、野生型RBM20が濃度依存的にスプライシング制御を行ったり、変異型RBM20が顆粒様構造を形成したりするのに関与するドメインについて、ドメイン全体の欠損やアミノ酸置換の変異体を作製して培養細胞に発現させることで、特定を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
2020年度中に論文を投稿し、採択されて出版に至った点は予定どおりである。
Rbm20遺伝子改変マウスを用いた個体レベルでの変異型RBM20タンパク質やそれと共存する他のタンパク質、RNAの解析については、新型コロナウイルス感染症による緊急事態宣言等の影響により研究のための時間が制約されたこと、利用しているマウス飼養保管施設の老朽化により他の飼養保管施設への移動を行ったこと、マウスの心筋細胞から長鎖mRNAを抽出する方法の検討に想定以上の時間を要したことから、必ずしも想定したスケジュールどおりには研究が進展しているとは言えない。
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| 今後の研究の推進方策 |
Rbm20遺伝子組換えマウスにおける内在性Ttn mRNAの全長シーケンス解析については、予備実験のシーケンスデータの解析を行った上で、現在手元にあるマウスの全遺伝子型（野生型、ヘテロ接合体、ホモ接合体）についてそれぞれTtn mRNAのシーケンス解析を試みる。一方、最近になって論文報告された、RBM20遺伝子の核局在に影響しない家族性拡張型心筋症変異について、ノックインマウスの作製を進めるとともに、細胞内局在やスプライシング制御機能への影響について詳細に検討している。変異型RBM20と共存するタンパク質やRNAについても同定を行う。野生型あるいは変異型RBM20の機能や局在に影響を与えるドメインについても、引き続き実験的に検証を行う。これらの解析を通じて、RBM20の正常機能やRBM20変異による拡張型心筋症の病態発現機構の解明を目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
マウスを用いた解析については、新型コロナウイルス感染症による緊急事態宣言等の影響により研究のための時間が制約があったこと、利用しているマウス飼養保管施設の老朽化により他の飼養保管施設への移動を行ったこと、マウスの心筋細胞から長鎖mRNAを抽出する方法の検討に想定以上の時間を要したことから、年度内にシーケンス解析の外部委託の費用が発生しなかった。同様に、RBM20の共存タンパク質の質量分析による同定の外部委託についても、試料の調製に至らず、費用が発生しなかった。
2021年度はこれらの実験が軌道にのることで、当初の計画どおりの外部委託を行い、データを得られる見通しである。
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