研究課題
本研究の目的は研究分担者により開発された速やかなタンパク質分解系であるAuxin Inducible Degron (AID)法を用いて、哺乳類培養細胞系において、人為的な細胞周期コントロールを行うことである。上記の目的を達成するためには細胞にとって低毒性かつ高効率なタンパク質分解系が必要不可欠となる。AID法を用いたタンパク質の分解には高濃度のオーキシンが必要となり、長時間の培養においては細胞毒性を示してしまうことがある。そのため、より低濃度での分解誘導を可能とする高感度AID法の開発に取り組み、従来のAID法よりも1000倍もの効率で分解誘導が可能であるSuper-sensitive (ss)AID法を構築することに成功した。次にこの方法を用いて細胞周期制御を行うためにCdk1、Cdk2、p16、p21、p27に注目した。dominant negative型Cdk1、Cdk2もしくはCDK阻害因子を細胞に過剰発現させることにより、細胞周期の停止を引き起こし、AID法による分解で、細胞周期のリスタートを試みた。Tet on systemを用いて、OsTIR1F74AとGFPとAID-tagとを付加したそれぞれの因子をHeLa細胞、マウスES細胞などに導入し、タンパク質分解を試みたが、Tet on systemにより標的タンパク質の発現量が多くなりすぎていたため、AID法によるタンパク質の除去が困難であることがわかった。次に細胞周期にかかわる因子をAID法で制御できる細胞株の作製を行った。その結果、Cdk1のAID細胞株ではCdk１の分解により、細胞周期がG2期で停止することが明らかとなった。ニワトリのDT40細胞株だけではなく、マウスのES細胞においても同様の結果が得られたことから、様々な細胞において、Cdk１の制御により、人為的な細胞周期制御が可能となると考えられた。
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