| 研究課題/領域番号 |
20K21427
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
竹中 瑞樹 京都大学, 理学研究科, 准教授 (10796163)
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| 研究期間 (年度) |
2020-07-30 – 2023-03-31
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| キーワード | PPRタンパク質 / 転写開始点制御 / オルガネラ / RNA結合タンパク質 |
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| 研究実績の概要 |
PPRタンパク質は35アミノ酸からなるRNA結合モジュールを繰り返し持ち、配列特異的にRNAと結合する。陸上植物ゲノムに数百個コードされているPPRタンパク質のほとんどはミトコンドリアや葉緑体などのオルガネラでRNAの転写、修飾、安定化、編集、翻訳など様々な転写後調節に関わっている。そのため、これまでPPRタンパク質はオルガネラに特化したRNA結合タンパク質だと考えられてきた。最近の研究により、赤色光シグナルによる転写開始点変化によってN末端側のシグナル配列を失い、細胞質に局在する短鎖PPRタンパク質が多数存在する可能性が示唆された。これらの短鎖PPRタンパク質はその構造上、細胞質でもRNA結合能を保持している可能性が高い。以下に当該年度に得られた成果を記す。
1）5’RACEの結果、これまで赤色光による制御により転写開始点が異なるとされてきたいくつかのPPR遺伝子の転写開始点を確認した。しかし、約60％については明確な転写開始点の変化を確認できなかった。
2）2種類のPPRタンパク質について、オルガネラに存在する長鎖バージョン、主に細胞質に局在する短鎖バージョンのPPRタンパク質をそれぞれクローニングし、これらを植物内で発現させた。シグナルペプチドを失った短鎖タンパク質が実際に細胞質に存在することをGFP融合タンパク質による細胞内局在観察により明らかにした。
3）PPRタンパク質の細胞質内での標的を解析するためにGFP融合タンパク質を発現させた形質転換体を用いて、ChiP-Seqを試みた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
1)赤色光依存的に転写開始点が変化し、それによってN末端の配列が変化するとされたPPRタンパク質遺伝子の転写開始点を5‘RACE法により確認した。明確な転写開始点変化が確認できた遺伝子の数は予想よりも少なかった。
2)それぞれの転写開始点から転写されたmRNAより合成される長短のタンパク質をそれぞれのGFP融合タンパク質を過剰発現させ、細胞内局在の解析を行った。２つのPPRタンパク質については細胞質への局在が確認された。
3)各PPRタンパク質遺伝子のシロイヌナズナノックアウト株に、長鎖または短鎖PPRのGFP融合タンパク質を過剰発現させた株の作成を行った。
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| 今後の研究の推進方策 |
解析を行う候補PPRタンパク質を絞りこむ。また、短鎖PPRタンパク質を過剰発現させた形質転換体の表現型解析を行う。現在、通常の生育条件では顕著な差が観察されていないが、光条件やさまざまなストレス条件下での表現型解析を行う。またPPRタンパク質の細胞質内での標的の同定のために、ChiP-seqの条件検討を行う。またPPRタンパク質とRNAの結合が不安定である可能性を考えて、UVクロスリンクの過程を含むCLIP法も試みる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
COVID19による研究活動の制限により、人件費の行使および実験計画がやや遅れている。また延期された国際学会の旅費を次年度使用分として活用する。
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