| 研究課題/領域番号 |
20K21468
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
中林 孝和 東北大学, 薬学研究科, 教授 (30311195)
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| 研究期間 (年度) |
2020-07-30 – 2023-03-31
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| キーワード | 液液相分離 / ラマンイメージング / 紫外共鳴ラマン散乱 / 水 / タンパク質 / 定量 / FUS |
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| 研究実績の概要 |
液液相分離によって生じたタンパク質液滴について、紫外共鳴ラマン測定などのラマン分光を用いて分析する新規手法を提案することを目的とする。2021年度は、筋萎縮性側索硬化症関連タンパク質FUSおよびそのLC (Low-complexity) 領域 (FUS-LC)、Ataxin-2、さらにマシャドジョセフ病関連タンパク質Ataxin-3について、再現性の高い液滴生成法を確立し、紫外共鳴ラマン測定、水のラマンバンドを用いた強度標準について検討した。紫外共鳴ラマン測定では、硫酸ナトリウムを強度標準とした濃度測定プロトコルを確立し、液滴形成に伴うタンパク質のラマンバンド間の相対強度の変化、ピーク位置の変化について検討した。Ataxin-3を用いて測定を行い、トリプトファン (Trp) とチロシン (Tyr) の共鳴ラマンバンドのピーク位置に液滴形成に伴う変化は無かったが、これらの一部のバンドで強度増加が観測された。共鳴するTrpとTyrの吸収バンドの微小変化を観測していることが考えられる。FUSについても紫外共鳴ラマンスペクトルとTyrの自家蛍光寿命と組み合わせた検討を行っている。ラマン顕微鏡を用いた液滴内のタンパク質のラベルフリー濃度測定では、FUS-LCを用い、pH・塩濃度・試料調製時のFUS-LCの濃度、これらの依存性について系統的な測定を行いさらに液滴の溶解剤として用いられるヘキサンジオール (HD) の添加に伴う液滴内濃度変化の測定も行った。HDの添加に伴い液滴内のFUS-LCの濃度が減少し、液滴内のFUS-LCの濃度がある閾値以下になると液滴が消滅する液滴消滅機構を提案することができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
Ataxin-2、Ataxin-3、FUS、FUS-LCなどのタンパク質の液滴を安定的に生成させることに成功し、強度や波数位置を十分に解析できるS/N比の紫外共鳴ラマンスペクトルの測定にも成功した。共鳴、非共鳴ともに液滴内のタンパク質濃度を定量するプロトコルを確立し、溶液環境の変化に伴う液滴の消滅過程について液滴内のタンパク質濃度からモデルを提案できた。
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| 今後の研究の推進方策 |
試料を核酸を含んだ液滴に拡張する。さらに、液滴の環境を系統的に変化させながら，液滴形成に伴うタンパク質内のトリプトファンやチロシン周囲の環境変化の検出を目指す．紫外共鳴ラマン散乱を用いて、液滴形成を行うタンパク質間の分子間相互作用の検出を目指す。
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