| 研究課題/領域番号 |
20K21470
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| 研究機関 | 筑波大学 |
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研究代表者 |
岩崎 憲治 筑波大学, 生存ダイナミクス研究センター, 教授 (20342751)
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| 研究分担者 |
竹中 聡 地方独立行政法人大阪府立病院機構大阪国際がんセンター(研究所), その他部局等, 整形外科部長 (00588379)
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| 研究期間 (年度) |
2020-07-30 – 2023-03-31
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| キーワード | 滑膜肉腫 / SS18-SSX / ヌクレオソーム |
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| 研究実績の概要 |
SSX2の2D NMR測定を行うための条件を決め、1H-15N HSQC、 1H-13C HSQC測定を950MHz NMRを用いて行った。SSX1のC末端34残基を発現・精製したGST- SSX1RD-Hisを用いて、2D NMRを行った。ヌクレオソームに対する結合をElectrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)で確認し、弱い結合であることを確認した。しかし、架橋剤の至適濃度を検討し、GST-SSX1RD-Hisヌクレオソームを安定複合体として得ることに成功した。さらに、GraFixと呼ばれる手法を用いて、GST-SSX1RD-His-ヌクレオソームをクライオ電子顕微鏡用の試料として単離精製することに成功した。単粒子解析に向けたクライオ電子顕微鏡による画像データをK3カメラを用いて約1万1千枚得た。本画像を用いた単粒子解析を始めた。一方、SS18-SSX1のSSX1領域（野生型SSX1の111-188の78残基に相当する。このフラグメントをSSX1(78）とする）が二重鎖DNAに結合することを示すEMSAのデータを得た。さらにヌクレオソームとSSX1（78）を用いた実験により、ヌクレオソームのリンカーDNA領域にSSX1（78）が結合することを示唆するデータを得た。さらにSSX1（78）を13C,15N安定同位体ラベルした試料を用いて、２D NMR測定を行った。リンカーDNAに相当するdsDNAフラグメントをSSX1（78）溶液に滴下していき、相互作用を示すデータを得た。ヌクレオソームとSSX1（78）を用いたフットプリントの実験を行い、SSX1（78）のヌクレオソームに対する結合領域を示唆するデータを得た。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
TLE1の発現実験やHDAC2阻害剤を用いた細胞実験などが、コロナ禍のため、プラスチック消耗品類が手に入らず、また出張実験ができず、計画通りに進んでいない。
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| 今後の研究の推進方策 |
SSX1RDのヌクレオソームたに対する結合様式をクライオ電子顕微鏡単粒子解析を用いて明らかにする。さらに、タグの無い状態のSSX1（78）とヌクレオソームとの複合体の構造解析をする。また、二重鎖DNAに対するSSX1（78）の結合定数や、SSX1RD,SSX18(78)のヌクレオソームに対する結合強度の測定を行い、現在提唱されている滑膜肉腫発症の元となる転写調節異常を引き起こすモデルの検証を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
TLE1の発現実験やHDAC2阻害剤を用いた細胞実験などが、コロナ禍のため、プラスチック消耗品類が手に入らず、また出張実験ができず、計画通りに進まなかった。これらの実験を阪大や大阪国際がんセンターと協力して行う。
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