| 研究課題/領域番号 |
20K21473
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
幸福 裕 東京大学, 大学院薬学系研究科(薬学部), 助教 (80737940)
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| 研究期間 (年度) |
2020-07-30 – 2023-03-31
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| キーワード | シグナル伝達 / 薬学 / 生物物理 / 蛋白質 |
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| 研究実績の概要 |
(1) モデルタンパク質を用いた安定同位体標識条件の最適化
前年度に引き続き、膜タンパク質などの核磁気共鳴（NMR）解析においてボトルネックとなっている、安定同位体標識技術の開発をおこなった。前年度までに緑色蛍光タンパク質（GFP）の発現量を指標に、培地に添加するアミノ酸や血清などの添加物の量、タイミングの検討を進めてきた。本年度は、モデルタンパク質として20種類のアミノ酸を含むチオレドキシン（Trx）を用いて、各アミノ酸残基の標識率を算出した。添加する標識アミノ酸の種類や量について検討した結果、14種類のアミノ酸残基について、部分重水素化を達成することに成功した。代表的な膜タンパク質であるGタンパク質共役型受容体（GPCR）について考えると、重水素化できた14種類のアミノ酸残基の水素原子は、膜貫通領域の水素原子の75%に相当する。このことから、本手法はGPCRをはじめとする様々な膜タンパク質のNMR解析に適用可能であると結論した。
(2) 開発した安定同位体標識法の膜タンパク質への適用
(1)で開発した安定同位体標識法が、実際の膜タンパク質のNMR解析に有用であることを実証するため、GPCRの一種であるβ2アドレナリン受容体について、安定同位体標識およびNMR解析をおこなった。その結果、これまでに申請者が確立済みである昆虫細胞を用いた標識条件と同様に、高感度かつ高分解能なNMR解析が可能であることがわかった。一方で、新たに開発した標識法は、昆虫細胞での発現量が少ない膜タンパク質にも適用可能であることから、これまでNMR解析が困難であった多くの創薬標的にもその適用範囲を拡大できるものであると考えた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究では、真核生物膜タンパク質の動的構造解析において、ボトルネックとなっている、安定同位体標識法を新規開発した上で、創薬標的膜タンパク質の解析に適用することを目指している。本年度までに、安定同位体標識技術を確立した上で、実際の創薬標的膜タンパク質のNMR解析に有用であることを示すことができた。これにより、これまでに解析が困難であった、様々な創薬標的膜タンパク質の動的構造解析が推進できる状況となったため、順調に進展していると考えた。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、確立した手法を、これまでにNMR解析が困難であった、様々な創薬標的膜タンパク質に適用することで、膜タンパク質の動作機構の解明を目指す。さらに、発現量が少ない、あるいは高分子量で測定感度が低い、などの理由により解析が難しい創薬標的にも適用範囲を拡大するため、より高い標識率、高い発現量で試料が調製できるように、安定同位体標識技術の最適化を進める。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
計画では、安定同位体標識率算出のためのモデルタンパク質を用いて小スケールでの条件検討をおこなった上で、実際の創薬標的膜タンパク質を用いて大スケールでの条件検討をおこなう予定であった。実際には、小スケールでの条件検討をより詳細におこなうなどの工夫により、高い標識率で安定同位体標識が可能な条件を効率的に探索することができた。その結果、実際の創薬標的膜タンパク質を用いた大スケールの条件検討について、手法確立までの培養回数を大幅に減らすことができた。これにより、必要経費が削減できたため、次年度使用額が生じた。
次年度は、様々な創薬標的膜タンパク質に適用するために、大スケールでの培養実験が多数回必要になる。そこで、これらの実験に必要な、安定同位体および標識用特注培地などに、次年度使用額を合わせて使用する。
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