| 研究課題/領域番号 |
20K21475
|
|---|
| 研究機関 | 金沢大学 |
|---|
研究代表者 |
加藤 将夫 金沢大学, 薬学系, 教授 (30251440)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2020-07-30 – 2023-03-31
|
| キーワード | 妊娠高血圧症候群 / 遺伝子組換えタンパク質 / アミノペプチダーゼ / アンジオテンシン / 薬物動態 / 降圧薬 / 動物モデル / 質量分析装置 |
|---|
| 研究実績の概要 |
Angiotensin II (ANG II)の加水分解酵素であるaminopeptidase A (APA)のヒト型遺伝子組換えタンパク質を合成し、妊娠高血圧症候群治療への有用性の検証を目的とした。前年度の本研究においてANG II分解活性を有するAPA組換えタンパク質rhAPAの合成と精製に成功するとともに、rhAPAをマウスに静脈内投与後の血中濃度推移の評価系を確立した。rhAPAは分子量が109kDと大きいため胎児移行性が低い利点が期待される。そこで本年度は、特に胎児移行性に着目し、rhAPAを投与後の臓器分布を検討するとともに、rhAPAのin vivoでの降圧作用を評価した。rhAPAをクロラミンT法で125I標識し、妊娠18日齢ICRマウスに単回静脈内投与し、γカウンターにより各組織及び胎児の放射活性を測定した。体内動態解析に十分な比活性を示し、非標識rhAPAと同程度の加水分解活性を有する125I-rhAPAが得られた。投与後1, 5, 120分後の各組織における放射活性を血漿中放射活性で除した値（Kp値）は肝でのみ1以上と高値を示した一方、他の臓器では0.05-0.5と低値を示した。肝臓のKp値は投与後1分から120分にかけて時間依存的に増加した一方、胎児における放射活性も経時的に増加したものの投与後120分でも投与量の0.49%であり、放射活性には分解物画分も含まれていたことから胎児移行性は極めて低いことが示唆された。次にrhAPAの薬理活性を評価するため、7週齢ICRマウスにrhAPAを単回静脈内投与し、20分後にANG IIを腹腔内投与後の血圧の経時変化を、非観式血圧計で観察した。その結果、ANG II投与後に血圧の増加が観察された一方、rhAPA投与による血圧低下は種々の投与量を検討したものの、溶媒のみの投与時の血圧変化と比べ顕著な違いがなかった。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
多くの降圧薬が胎盤を通過し妊婦に禁忌であるため、妊娠高血圧症候群に対する有効な降圧薬は乏しい。rhAPAは高分子であるが故に胎盤を通過せず、元来ヒトに存在するタンパク質であることから、免疫原性も低く、既存の低分子降圧薬よりも胎児毒性が少ないことが期待される。そこで本年度はrhAPAの胎児移行性を含む臓器分布と、ANG II投与による高血圧マウスに及ぼす薬理効果を評価した。胎児移行性の評価系としては最も感度が高いと思われる放射標識法を用いたところ、rhAPAの胎盤透過は極めて小さいことが示され、仮説が支持された。しかしながら、今回の検討は単回投与のみであり、繰り返し投与についてさらなる検討が必要である。また放射標識法では組換えタンパク質と分解物の区別が難しく、intactなタンパク質がどの程度胎盤を通過したかについてはさらに検討が必要である。マウスとヒトとの透過の種差も考えられる。したがって今後は、ヒト胎盤組織を用いた胎盤灌流系などを用い、ヒトでの胎盤透過の有無をより定量的に評価する必要がある。今年度、ANG II高血圧マウスにおいてrhAPA投与後の明確な降圧作用が観察されなかった。昨年度のin vitro実験系においてrhAPAはANG II分解活性を示しており、ある程度の生物活性を有していると考えられるが、in vivoで効果を示すにはより強い活性を有する必要がある。一方で、今回用いた非観式血圧計は現在市販されていない古い型式であり、結果がやや安定しない欠点があった。今後はより結果の安定する血圧計を用いた検討が必要である。また、ANG II投与による高血圧モデルはrhAPAの生物活性をin vivoで評価する簡便な系であり、他の薬物に対する論文報告はあるものの、病態モデルではない。妊娠高血圧症候群により近い動物モデルの作製も必要である。
|
| 今後の研究の推進方策 |
現在、rhAPAの血中安定性を高め、より強い薬理効果を示す組換えタンパク質作製のため、各種の融合タンパク質を予備的に作製している。rhAPAとの融合タンパク質作製にあたっては、現在、１週間程度かかる組換えタンパク質合成・精製系を、多種類のタンパク質の合成・精製に対応可能な、より簡便な系に改良する予定である。さらに、融合するタンパク質の種類やrhAPAとのリンカー部位の最適化を行う目的で、種々の組換えタンパク質を合成・精製するとともに、当該タンパク質のANG II分解活性とマウスin vivoでの静脈内投与後の血中安定性、ヒト肝細胞に添加後の安定性を評価する方針である。以上の検討により、高い薬理活性を示すrhAPAが得られることが期待される。一方、今年度の胎児移行性評価の発展系として、ヒト胎盤灌流系を用いた透過試験の確立も行う予定である。すでにヒトでの胎盤透過が報告されている化合物やタンパク質を対照として用いることで試験系の妥当性を評価した後、rhAPAの胎盤透過を評価したいと考えている。ヒト胎盤は共同研究者から供与される予定ではあるが、検体数は少なく貴重であるため、ラット等の実験動物を用いた予備検討は必須であり、すでに準備を進めている。さらに、妊娠高血圧症候群モデル動物を用いたrhAPAの薬効評価系の構築も進める。そのためには安定した結果の得られる障害モデル動物の作製が必須であり、以前に十分な評価ができなかったreduced uterine perfusion pressureやN-nitro-l-arginine methylesterモデル等、他の研究グループが確立してきた系を応用するため、実験条件を種々変更させ、最適化を行う予定である。
|
