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2020 年度 実施状況報告書

脳ゲノム編集および幹細胞由来オルガノイド融合による霊長類精神疾患モデルの創出

研究課題

研究課題/領域番号 20K21476
研究機関名古屋大学

研究代表者

小坂田 文隆  名古屋大学, 創薬科学研究科, 准教授 (60455334)

研究期間 (年度) 2020-07-30 – 2022-03-31
キーワードオルガノイド / 幹細胞 / マーモセット / CRISPR/Cas9 / ゲノム編集 / アッセンブロイド / 非ヒト霊長類
研究実績の概要

自閉スペクトラム症を初めとする精神発達障害の発症において、遺伝的要因が強く影響することが疫学的に示されてきた。近年のゲノム解析技術により、精神障害の発症に関連する遺伝子変異や染色体異常が同定された。しかし、見出されたゲノム変異により生じる病態の解明には至っていない。今後、精神障害に対する治療法・診断法開発や創薬へと繋げるためには、分子病態および神経回路異常の解明が喫緊の課題である。そこで本研究課題では、精神疾患の病態発症機序となる分子・神経回路異常を明らかにする目的で、霊長類のマーモセットを用いてin vitroおよびin vivoの病態モデルの作製を目指す。具体的には、(i) 神経細胞の標的ゲノム部位に外来遺伝子を挿入可能なゲノム編集技術の開発、(ii) マーモセット胚性幹細胞(ES細胞)由来複合オルガノイドによる領野間神経回路再構成法の開発を目指す。
(i) 成体マウス脳を構成する非分裂細胞である神経細胞にてゲノム標的配列に自由に外来遺伝子を挿入可能なゲノム編集技術を確立するために、CRISPR/Cas9システムを搭載したアデノ随伴ウイルスベクター(AAV)を構築した。標的配列を特異的に認識・切断するために、複数のgRNAをデザインし、T7E1 assayにより最適なgRNAを見出した。標的遺伝子座にGFPをノックインするために、AAVを成体マウスの第一次視覚野に微量注入し、GFPの発現を検証した。
(ii) マーモセットES細胞から大脳皮質オルガノイドを誘導する。まずES細胞から外胚葉への誘導するための浮遊培養条件を最適化した。神経分化の指標であるSox1の発現およびロゼッタ構造の形成、さらには大脳皮質への分化誘導の指標であるFoxG1, Pax6, bIII-tubulinなどの発現が認められた。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

ゲノム編集に必要なウイルスベクターの作製およびマウス脳での検証、マーモセットES細胞からの大脳皮質オルガノイドへの誘導が達成され、計画通りに実施できたため。

今後の研究の推進方策

今後は、成体ゲノム編集の効率および特異性の検証、血液脳関門透過型AAVの検証、マーモセットES細胞からの視床オルガノイドの作製を行う予定である。

  • 研究成果

    (15件)

すべて 2021 2020

すべて 雑誌論文 (5件) (うち査読あり 4件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (10件) (うち招待講演 4件)

  • [雑誌論文] Cell type- and layer-specific convergence in core and shell neurons of the dorsal lateral geniculate nucleus2021

    • 著者名/発表者名
      Okigawa S, Yamaguchi M, Ito KN, Takeuchi RF, Morimoto N, Osakada F
    • 雑誌名

      J Comp Neurol

      巻: 529 ページ: 2099-2124

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Temporally multiplexed dual-plane imaging of neural activity with four-dimensional precision2021

    • 著者名/発表者名
      Onda M, Takeuchi RF, Isobe K, Suzuki T, Masaki Y, Morimoto N, Osakada F
    • 雑誌名

      Neurosci Res

      巻: - ページ: -

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Efficient and robust induction of retinal pigment epithelium cells by tankyrase inhibition regardless of the differentiation propensity of human induced pluripotent stem cells2021

    • 著者名/発表者名
      Ito A, Ye K, Onda M, Morimoto N, Osakada F
    • 雑誌名

      Biochem Biophys Res Commun

      巻: - ページ: -

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Reproducible production and image-based quality evaluation of retinal pigment epithelium sheets from human induced pluripotent stem cells2020

    • 著者名/発表者名
      Ye K, Takemoto Y, Ito A, Onda M, Morimoto N, Mandai M, Takahashi M, Kato R, Osakada F
    • 雑誌名

      Sci Rep

      巻: 10 ページ: 14387-14401

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] G欠損狂犬病ウイルスベクター2020

    • 著者名/発表者名
      山口真広, 小坂田文隆
    • 雑誌名

      実験医学別冊 決定版 ウイルスベクターによる遺伝子導入実験ガイド

      巻: なし ページ: 57-72

  • [学会発表] 感覚運動誤差の脳内表現2021

    • 著者名/発表者名
      小坂田文隆
    • 学会等名
      若手新分野創成ワークショップ「脳を知り、疾患を理解する」
    • 招待講演
  • [学会発表] 視覚-運動連関を担う神経回路メカニズム2021

    • 著者名/発表者名
      小坂田文隆
    • 学会等名
      第30回神経行動薬理学若手研究者の集い
    • 招待講演
  • [学会発表] Generation of Cortical Organoids with Axial Polarity from Marmoset Embryonic Stem Cells2021

    • 著者名/発表者名
      小寺知輝、原大樹、森本菜央、小坂田文隆
    • 学会等名
      日本薬理学会
  • [学会発表] Toward the generation of thalamic organoids from human induced pluripotent stem cells2021

    • 著者名/発表者名
      西村優利、森本菜央、小坂田文隆
    • 学会等名
      日本薬理学会
  • [学会発表] 非遺伝子改変動物における細胞種特異的なウイルス感染法の開発2021

    • 著者名/発表者名
      釜口 力, 大月 祥子, 山口 真広, 田村 朋則, 森本 菜央, 浜地 格, 小坂田文隆
    • 学会等名
      日本薬学会
  • [学会発表] セロトニン作動性ニューロンがショウジョウバエ聴覚応答の行動時間を調節する2020

    • 著者名/発表者名
      森本 菜央、恩田 将成、石田 彩乃、竹内 遼介、磯部 圭佑、上川内 あづさ、小坂田文隆
    • 学会等名
      第43回日本神経科学大会
  • [学会発表] 神経回路の構造と機能を明らかにするウイルス遺伝子工学とイメージング技術2020

    • 著者名/発表者名
      小坂田文隆
    • 学会等名
      視覚科学フォーラム2020
    • 招待講演
  • [学会発表] 神経回路の相互作用解析を可能にする新規ウイルスベクターの開発2020

    • 著者名/発表者名
      岩田萌, 入江崇, 川端涼子, 鈴木俊章, 森本菜央, 坂口剛正, 中西真人, 小坂田文隆
    • 学会等名
      日本薬学会
  • [学会発表] 神経回路を標識する狂犬病ウイルスベクターの開発とその応用2020

    • 著者名/発表者名
      小坂田文隆
    • 学会等名
      東京大学医学部機能生物学セミナー
    • 招待講演
  • [学会発表] Multimodal integration in the core region of the dorsal lateral geniculate nucleus revealed by the monosynaptic rabies virus tracing2020

    • 著者名/発表者名
      沖川沙由美、小坂田文隆
    • 学会等名
      日本分子生物学会

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公開日: 2021-12-27  

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