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本研究は、中分子に特有の課題である細胞膜透過性の評価および膜透過活性の付与に挑戦し、その活用を推進するNMR基盤技術を構築することで、中分子の活用が拓く新たな生物学的・創薬科学的な革新を誘起することを目的とする。現在、膜透過を評価する方法としては大きく分けて、培養細胞層を用いる方法、人工膜を用いた方法、蛍光標識を施して細胞内移行を観察する方法があるが、現存する方法にはそれぞれ、問題があり、中分子の膜透過評価手法としては不完全である。そこで、本研究では、免疫抑制効果を示す中分子シクロスポリン（CsA）とその細胞内標的であるシャペロンタンパク質PPIAの相互作用を用いて、中分子が細胞膜を通過し、細胞内の標的に対して結合する速度および解離する速度をin-cell NMR法により生きた細胞で直接評価する技術を確立した。なお、PPIAはCsAを最終標的であるカルシニューリンに結合しやすい構造に固定することで、CsAの活性を補助する。
細胞の外から一定濃度のCsAを供給する一方で、細胞内には安定同位体標識したPPIAを導入し、標的タンパク質のシグナルを連続的にNMR観測することで、CsAのPPIAへの結合に伴うスペクトル変化から、膜透過速度および特異的な標的への結合、さらには解離をin situで評価することに成功した。またその際、細胞内に豊富に存在するPPIAが、水にほとんど溶けないCsAを膜から引き抜き、トラップされることを防ぐことで、効率的な細胞内移行にも寄与していることも期待された。しかし、PPIAの濃度に依らす、膜透過速度は一定であったことから、期待したような加速効果を観測することはできなかった。しかしながら、今回は比較的高濃度のPPIAを用いたことから、膜の引き抜きが律速にならなかった可能性もあり、引き続き検討を行う。
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