| 研究課題/領域番号 |
20K21593
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
正宗 淳 東北大学, 医学系研究科, 教授 (90312579)
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| 研究分担者 |
古本 祥三 東北大学, サイクロトロン・ラジオアイソトープセンター, 教授 (00375198)
濱田 晋 東北大学, 医学系研究科, 助教 (20451560)
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| 研究期間 (年度) |
2020-07-30 – 2023-03-31
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| キーワード | 細胞老化 |
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| 研究実績の概要 |
本年度は市販のリコンビナントヒトβガラクトシダーゼを用いた活性測定・HEK293細胞にヒトβガラクトシダーゼを導入した細胞株のライセートを用いた活性測定により、薬剤スクリーニングが可能であるか検証した。本年度に使用したリコンビナントβガラクトシダーゼでは、2-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside分解による発色反応を利用した活性測定キットで検出可能な活性を確認できないとの結果であった。βガラクトシダーゼ導入HEK293細胞についても、発現レベルの低下や細胞自体の老化誘導による非特異反応など、培養条件による活性の変化のため、安定したスクリーニング系としての使用は困難と判断した。
確実なヒトβガラクトシダーゼの発現があり、培養条件による細胞老化の誘導が内因性のβガラクトシダーゼ活性を変化させない細胞を探索したところ、βガラクトシダーゼノックアウトマウス由来線維芽細胞へヒトβガラクトシダーゼ遺伝子を導入した不死化細胞株が存在することが明らかになったため、細胞バンクから入手しβガラクトシダーゼ活性を評価した。該当細胞は大量培養が可能であり、複数回の継代によっても細胞ライセート中のβガラクトシダーゼ活性が安定的に評価可能であった。薬剤スクリーニングの実施には発色反応系のスケールアップが必要であるため、既報にしたがいアッセイ条件の最適化を進める予定である。より高感度な活性測定法の利用が必要な場合に備え、SPiDER-βGal等の蛍光ベースでの検出系も確立予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
信頼性の高いβガラクトシダーゼ発現細胞が利用可能となり、活性測定系の最適化が済み次第薬剤スクリーニングへの着手が可能となるため、おおむね順調に進展している。
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| 今後の研究の推進方策 |
複数の活性測定系を利用した薬剤スクリーニングを進めるとともに、実際のβガラクトシダーゼ発現細胞を用いて細胞内での薬物滞留性の評価も進める予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度は至適細胞株の選定・機能評価に時間を要したため、未使用額が生じた。次年度以降は薬物スクリーニングで支出の増加が見込まれるため、未使用額と併せて使用予定である。
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