研究課題
本研究は、不整脈源性心筋症症例からの疾患iPS細胞樹立及びアイソジェニック細胞セットの作成、iPS細胞分化心筋を用いた機能解析と病態解明、アデノ随伴ウイルス(AAV)を用いた遺伝子導入による治療概念の実証を目的とした。2020年度は、アイソジェニックiPS細胞セット作成を完了し、iPS細胞の品質評価を行うとともに、droplet digital PCRやウェスタンブロットを用いたアレル特異的転写産物発現の評価、野生型及び変異タンパク質発現の評価を行った。次いで、アイソジェニックiPS細胞セットを心筋に分化させ、モーションベクトル解析による収縮機能評価、免疫染色やウェスタブロットによる関連タンパク質発現、局在評価を行った。同時に、2020年度はヒトiPS分化心筋へのAAVによる遺伝子導入、及び分化心筋を用いた機能解析を目的としたイメージング系の確立を行った。心筋に特異的に発現するミオシン調節軽鎖タンパク質（Myl2遺伝子）の3’末端にtdTomato蛍光タンパク質をノックインする評価系を用いて、アデノ随伴ウイルス（AAV）によるガイドRNAと修復テンプレートDNAの導入により、Cas9ノックインマウス成獣心臓組織の非分裂心筋細胞において相同組み換え（HDR）が生じることを見出した。更にこの方法を応用し、ヒトMYL2遺伝子をターゲットとしたtdTomato蛍光タンパク質のノックインを試みた。ヒトiPS分化心筋細胞に対してAAVによる遺伝子導入により直接HDRを生じさせ、分化後の心筋細胞においてサルコメア収縮を可視化する系を確立し報告した。
2: おおむね順調に進展している
本研究開発は、1. 遺伝性ARVC症例からの疾患iPS細胞樹立及びアイソジェニック細胞セットの作成、2. iPS細胞分化心筋を用いた機能解析と病態解明、3. アデノ随伴ウイルス(AAV)を用いた遺伝子導入による治療概念の実証を目的とする。2020年度は、1、及び2について、当初目的としたアイソジェニックiPS細胞セット作成が完了し、iPS細胞の品質評価、droplet digital PCRやウェスタンブロットを用いたアレル特異的転写産物発現の評価、野生型及び変異タンパク質発現の評価が完了した。次いで、アイソジェニックiPS細胞セットを心筋に分化させ、モーションベクトル解析による収縮機能評価、免疫染色やウェスタブロットによる関連タンパク質発現、局在評価を行った。これら研究成果を、第6回日本心筋症研究会にて報告した。
当初目的に則り、iPS細胞分化心筋を用いた機能解析と病態解明、アデノ随伴ウイルス(AAV)を用いた遺伝子導入による治療概念の実証を継続する。アイソジェニックiPS細胞から分化させた心筋細胞を用いて、モーションベクトル解析、ラベルフリーイメージングによる興奮伝導解析、タンパク質発現解析を行う。同時に、ハイコンテントイメージングを用いた単細胞カルシウムイメージング、デスモゾーム関連タンパク質の局在解析を行い、AAVによる遺伝子導入と組み合わせた機能解析を推進する。更に、2020年度に確立したゲノム編集の方法論を応用し、ヒト分化心筋を用いた分子イメージング細胞の樹立を試みる。
COVID-19蔓延により、研究の一部が遅延し、また当初予定していた学会発表等に伴う旅費が発生せず、繰越額が生じた。次年度使用額について、当初の研究計画目的であるiPS分化心筋を用いた機能解析に使用していく予定である。
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Scientific Reports
巻: 10 ページ: 15348
10.1038/s41598-020-72216-y
http://www.cardiology.med.osaka-u.ac.jp/?page_id=33635
