完全無タンパク質条件下における造血幹細胞の培養システムの確立

2020 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 20K21612
• 研究機関: 筑波大学
• 研究代表者: 山崎 聡 筑波大学, 医学医療系, 教授 (50625580)
• 研究期間 (年度): 2020-07-30 – 2022-03-31
• キーワード: 造血幹細胞 / 無タンパク質培養

研究実績の概要

造血幹細胞の性質や分子機構の解明を目指し、研究に取り組んでいる。これまでマウス造血幹細胞の骨髄ニッチを構成する細胞として非ミエリン髄鞘シュワン細胞を同定した(Yamazaki S et al., Cell 2011)。また、長期骨髄再建能をもつ造血幹細胞に特異的な遺伝子Hoxb5を同定し、Hoxb5レポーターマウスの骨髄に対し透明化試薬を用いて透明化したうえで3次元によるイメージング解析を行い、VE-カドヘリン陽性の血管内皮細胞が長期造血幹細胞のニッチとして働いていることを明らかにした(James YC et al., Nature 2016)。最近では、骨髄中には骨髄特有のアミノ酸濃度が存在し、そのアミノ酸バランスを崩すことで造血幹細胞を制御できることを明らかにしている(Taya et al., Science 2016)。
一方で様々なことが明らかになる中で造血幹細胞のex vivoでの増幅は困難であった。多くの実験を繰り返す中で、申請者は培養中のアルブミンという成分の不安定さに着目した。また、高純度のアルブミン製剤を造血幹細胞の培養に用いることで未分化性を現行の培養条件よりも維持可能であることを見出した（Ietasu et al., Stem Cell Rports.2017）。さらには、アルブミンをPVAというポリマーに置き換えることにより造血幹細胞を長期間培養し１００倍以上の増幅に世界で初めて成功した（Wilkinson et al.,Nature 2019）。この発見と成功が今回の研究課題の提案に至った経緯であり、非常に夢のある目標でありながら近未来に向けた医科学に対する貢献度は非常に大きいと期待される。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

すでに、ヒト造血幹前駆細胞の増幅をサイトカインを用いないで可能な条件を発見したことから

今後の研究の推進方策

造血幹細胞（HSC)の培養後の機能が高いHSCと培養後のHSCが全く生着を示さなかった化合物群に分けて解析をする。また長期培養系と限界希釈法また１細胞培養増幅系により増幅した細胞を放射線照射したマウスに移植し解析する評価系によりHSCがどの程度の期間培養可能なのか、さらに何倍増幅したかを定量的かつ詳細に明らかにする。後者に関しては培養後に増殖した細胞を対象に１細胞RNAseqを行い分化してきた細胞がどのような細胞なのかを遺伝子発現レベルで解析を行う。
本研究課題である完全無タンパク質培養方法の確立により長期間の幹細胞性維持と大幅な増幅技術開発という研究目的を達成する。

次年度使用額が生じた理由

次年度使用額が生じた理由：新型コロナウィルス感染症による影響、生産流通量減少による試料の欠品・受注停止。
使用計画：SCF、TPO、ITS、トランスフェリンの4因子マイナス (-)１因子の培地を作成し基礎培養液としては PVAを用いたタンパク質を全く添加していない培養液を作成する。その培地へ化合物ライブラリーを加えHSCを１週間培養する。その際にHSCからの細胞増殖が５倍以上であった化合物を陽性とし、２次スクリーニングへの移行対象物とする。２次スクリーニングでは増殖因子を用いずに全て化合物によりHSCの細胞増殖率を１次スクリーニングの評価方法と同様に解析する。候補分子と組み合わせを同定する。一方でPVAは重合度とケン化度の違いにより性質が変化し低分子化合物との相性や反応を左右することが懸念されていることから、異なるPVAを用いた培養条件下においても同様のスクリーニングを実施する。

研究成果

• [雑誌論文] DHODH inhibition synergizes with DNA-demethylating agents in the treatment of myelodysplastic syndromes (2021)
  • 著者名/発表者名: Kayamori K, Nagai Y, Zhong C, Kaito S, Shinoda D, Koide S, Kuribayashi W, Oshima M, Nakajima-Takagi Y, Yamashita M, Mimura N, Becker HJ, Izawa K, Yamazaki S, Iwano S, Miyawaki A, Ito R, Tohyama K, Lennox W, Sheedy J, Weetall M, Sakaida E, Yokote K, Iwama A.
  • 雑誌名: Blood Adv 巻: 5 ページ: 438-450
  • DOI: 10.1182/bloodadvances.2020001461.
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Limited rejuvenation of aged hematopoietic stem cells in young bone marrow niche (2021)
  • 著者名/発表者名: Kuribayashi W, Oshima M, Itokawa N, Koide S, Nakajima-Takagi Y, Yamashita M, Yamazaki S, Rahmutulla B, Miura F, Ito T, Kaneda A, Iwama A.
  • 雑誌名: J Exp Med 巻: 218 ページ: e20192283
  • DOI: 10.1084/jem.20192283.
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Transcription factor 21 expression in injured podocytes of glomerular diseases (2020)
  • 著者名/発表者名: Usui J, Yaguchi M, Yamazaki S, Takahashi-Kobayashi M, Kawamura T, Kaneko S, Seshan SV, Ronco P, Yamagata K.
  • 雑誌名: Sci Rep 巻: 10 ページ: 11516
  • DOI: 10.1038/s41598-020-68422-3.
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Activated HoxB4-induced Hematopoietic Stem Cells from Murine Pluripotent Stem Cells via Long-Term Programming (2020)
  • 著者名/発表者名: Izawa K, Yamazaki S, Becker HJ, Bhadury J, Kakegawa T, Sakaguchi M, Tojo A.
  • 雑誌名: Exp Hematol 巻: 89 ページ: 68-79
  • DOI: 10.1016/j.exphem.2020.08.003.
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] The impact of cell maturation and tissue microenvironments on the expression of endosomal Toll-like receptors in monocytes and macrophages (2020)
  • 著者名/発表者名: Sato R, Reuter T, Hiranuma R, Shibata T, Fukui R, Motoi Y, Murakami Y, Tsukamoto H, Yamazaki S, Liu K, Saitoh SI, Latz E, Miyake K.
  • 雑誌名: Int Immunol 巻: 32 ページ: 785-798
  • DOI: 10.1093/intimm/dxaa055.
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Generation of a p16 Reporter Mouse and Its Use to Characterize and Target p16high Cells In Vivo (2020)
  • 著者名/発表者名: Omori S, Wang TW, Johmura Y, Kanai T, Nakano Y, Kido T, Susaki EA, Nakajima T, Shichino S, Ueha S, Ozawa M, Yokote K, Kumamoto S, Nishiyama A, Sakamoto T, Yamaguchi K, Yamazaki S,
  • 雑誌名: Cell Metab 巻: 32 ページ: 814-828
  • DOI: 10.1016/j.cmet.2020.09.006.
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] A. Efficacy of the Novel Tubulin Polymerization Inhibitor PTC-028 for Myelodysplastic Syndrome (2020)
  • 著者名/発表者名: Zhong C, Kayamori K, Koide S, Shinoda D, Oshima M, Nakajima-Takagi Y, Nagai Y, Mimura N, Sakaida E, Yamazaki S, Iwano S, Miyawaki A, Ito R, Tohyama K, Yamaguchi K, Furukawa Y, Lennox W, Sheedy J, Weetall M, Iwama A.
  • 雑誌名: Cancer Sci 巻: 111 ページ: 4336-4347
  • DOI: 10.1111/cas.14684.
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] 生体外におけるヒトiPS細胞由来造血幹細胞の増幅技術開発 (2021)
  • 著者名/発表者名: 山崎 聡
  • 学会等名: 第20回日本再生医療学会総会
  • 招待講演
• [学会発表] 造血幹細胞の増幅を用いた完全なるゲノム編集とその応用 (2021)
  • 著者名/発表者名: 山崎 聡
  • 学会等名: 第20回日本再生医療学会総会
  • 招待講演
• [学会発表] 造血幹細胞の増幅とぞの技術開発で見えてくる未来 (2021)
  • 著者名/発表者名: 山崎 聡
  • 学会等名: 日本化学会１０１春季年会
  • 招待講演
• [学会発表] 造血幹細胞の生体外増幅 (2020)
  • 著者名/発表者名: 山崎 聡
  • 学会等名: 日本再生医療学
  • 招待講演
• [学会発表] 細胞学研究の最先端 (2020)
  • 著者名/発表者名: 山崎 聡
  • 学会等名: 第38回日本ヒト細胞学会学術集会
  • 招待講演
• [学会発表] 造血幹細胞の増幅の可能性 (2020)
  • 著者名/発表者名: 山崎 聡
  • 学会等名: 第27回日本輸血・細胞治療学会秋季シンポジウム
  • 招待講演