一細胞解析による肺炎球菌感染時の宿主転写応答の解明

2020 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 20K21675
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 川端 重忠 大阪大学, 歯学研究科, 教授 (50273694)
• 研究分担者: 山口 雅也 大阪大学, 歯学研究科, 講師 (00714536) ; 住友 倫子 大阪大学, 歯学研究科, 講師 (50423421) ; 中田 匡宣 鹿児島大学, 医歯学域歯学系, 教授 (90444497)
• 研究期間 (年度): 2020-07-30 – 2022-03-31
• キーワード: 肺炎球菌 / 肺胞洗浄液（BALF） / シングルセル解析

研究実績の概要

口腔レンサ球菌の一種である肺炎球菌は、肺炎の主たる起因菌である。肺炎球菌性肺炎では、宿主の過剰な炎症応答が組織を破壊し、菌が深部へ伝播すると考えられている。一方で、感染によりどのような細胞集団が遊走されるか、また細胞集団が感染にそれぞれどのように応答しているのか、詳細な情報は今まで明らかとなっていない。本研究は、感染によって引き起こされる宿主のRNA転写およびゲノムワイドのオープンクロマチン領域の変化を細胞集団ごとに解析することで、これまでにない精度での宿主応答の解明手段の確立を試みるものである。
初年度は、肺炎球菌感染24時間後の肺胞洗浄液中の菌数ならびに血中の菌数の測定を行った。その結果、感染菌数に比例して肺胞洗浄液中の菌数と血中へ移行する菌数が増加することが示唆された。また、感染マウスから肺を摘出して、ホルマリン固定とパラフィン包埋を行い、薄切切片を作成した。得られた切片についてHE染色を行った後に観察したところ、炎症応答が引き起こされていることが示唆された。次に、肺胞洗浄液を用いたシングルセル解析の条件検討を行った。一細胞解析には傷害を受けていない細胞が必要である。しかし、感染後の肺胞洗浄液においては一定の割合で細胞死が引き起こされているとともに細胞デブリが含まれ、シングルセル単離を行うのに厳しい条件であった。今後はBALFから死亡した細胞とデブリを取り除くための処理を行った上でシングルセル解析を行う。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

研究初年度においては、新型コロナウイルス感染症の影響により、実験時間が制約されたとともに、研究計画を遂行する上で必要なマスクや手袋などの欠品が起きた。これらのことから、当初予定していた計画の一部が遂行できなかった。そのため、進捗状況を「やや遅れている」と判断した。

今後の研究の推進方策

次年度においては、研究実績の概要に示したように、マウス肺炎モデルから得た肺胞洗浄液について、細胞デブリを密度勾配遠心により除き、死細胞を磁気標識してマグネットを用いて除去する。得られた細胞についてシングルセル単離と微量遺伝子増幅とRNA-seqを行い、遺伝子応答から細胞集団のクラスタリングを行う。さらに、細胞集団ごとの転写応答の違いを決定する。感染サンプルから細胞を単離する技術を確立した上で、単離した細胞から核の抽出を行う。核の品質を確保した上で、当初の研究計画に沿って実験を遂行する。

次年度使用額が生じた理由

研究初年度においては、新型コロナウイルス感染症の影響により、実験時間が制約されたとともに、国内外の多くの学会が中止またはオンライン開催となった。また、研究計画を遂行する上で必要な物品の欠品が起きた。これらのことから、当初予定していた計画の一部が遂行できず、次年度使用額が生じた。次年度においては、消耗品や次世代シーケンス解析の委託費として用いるとともに、研究遂行を加速するため、派遣研究員を雇用する。

研究成果

• [国際共同研究] カリフォルニア大学サンディエゴ校(米国)
  • 国名: 米国
  • 外国機関名: カリフォルニア大学サンディエゴ校
• [雑誌論文] Epidemiological Analysis of Pneumococcal Strains Isolated at Yangon Children's Hospital in Myanmar via Whole-genome Sequencing-based Methods. (2021)
  • 著者名/発表者名: Yamaguchi M., Myo Win H. P., Higashi K., Ono M., Hirose Y., Motooka D., Okuzaki D., Aye M. M., Htun M. M., Thu H. M., Kawabata S.
  • 雑誌名: Microb. Genomics 巻: 7 ページ: －
  • DOI: 10.1099/mgen.0.000523
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Respiratory FimA-specific secretory IgA antibodies upregulated by DC-ta-getting nasal double DNA adjuvant are essential for elimination of Porphyromonas gingivalis. (2021)
  • 著者名/発表者名: Kataoka K., Kawabata S., Koyanagi K., Hashimoto Y., Miyake T., Fujihashi K.
  • 雑誌名: Front. Immunol. 巻: 12 ページ: 634923
  • DOI: 10.3389/fimmu.2021.634923
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Streptococcus pyogenes upregulates arginine catabolism to exert its pathogenesis on the skin surface. (2021)
  • 著者名/発表者名: Hirose Y., Yamaguchi M., Sumitomo T., Nakata M., Hanada T., Okuzaki D., Motooka D., Mori Y., Kawasaki H., Coady A., Uchiyama S., Hiraoka M., Zurich R.H., Amagai M., Nizet V., Kawabata S.
  • 雑誌名: Cell Rep. 巻: 34 ページ: 108924
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2021.108924
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Role of BgaA as a pneumococcal virulence factor elucidated by molecular evolutionary analysis. (2020)
  • 著者名/発表者名: Yamaguchi M, Takemura M, Higashi K, Goto K, Hirose Y, Sumitomo T, Nakata M, Uzawa N, Kawabata S.
  • 雑誌名: Front. Microbiol. 巻: 11 ページ: 582437
  • DOI: 10.3389/fmicb.2020.582437
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Genetic characterization of Streptococcus pyogenes emm89 strains isolated in Japan from 2011 to 2019. (2020)
  • 著者名/発表者名: Hirose Y., Yamaguchi M., Takemoto N., Miyoshi-Akiyama T., Sumitomo T., Nakata M., Ikebe T., Hanada T., Yamaguchi T., Kawahara R., Okuno R., Otsuka H., Matsumoto Y., Terashima Y., Kazawa Y., Nakanishi N., Uchida K., Akiyama Y., Iwabuchi K., Nakagawa C., Yamamoto K., Nizet V., Kawabata S.
  • 雑誌名: Infect. Microbe Dis. 巻: 2 ページ: 160-166
  • DOI: 10.1097/IM9.0000000000000038
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] ミャンマーで分離された肺炎球菌のシーケンス情報を用いた遺伝子プロファイリングとパンゲノム解析． (2021)
  • 著者名/発表者名: 山口雅也，Hpoo Pwint Myo Win，大野誠之，東孝太郎，広瀬雄二郎，Mya Mya Aye，Moh Moh Htun，Hlaing Myat Thu，川端重忠．
  • 学会等名: 第94回日本細菌学会総会
• [学会発表] 細胞接着分子を標的とする病原性レンサ球菌の感染戦略． (2021)
  • 著者名/発表者名: 住友倫子．
  • 学会等名: 第94回日本細菌学会総会
  • 招待講演
• [学会発表] 鼻咽腔に定着する肺炎球菌が非血行性に脳へ伝播する機構の解析． (2021)
  • 著者名/発表者名: 高原悠樹，住友倫子，河野正充，山口雅也，中田匡宣，保富宗城，川端重忠．
  • 学会等名: 第94回日本細菌学会総会
• [学会発表] emm89型化膿レンサ球菌による侵襲性感染症の発症因子の遺伝統計学的探索 (2021)
  • 著者名/発表者名: 大野誠之，山口雅也，広瀬雄二郎，東孝太郎，竹本訓彦，秋山徹，住友倫子，池辺忠義，川端重忠．
  • 学会等名: 第94回日本細菌学会総会
• [学会発表] 結晶構造解析に基づく化膿レンサ球菌におけるヒアルロン酸分解酵素の分子機構解明 (2021)
  • 著者名/発表者名: 東 孝太郎，山口雅也，中田匡宣，武部克希，住友倫子，鈴木守，川端重忠．
  • 学会等名: 第94回日本細菌学会総会
• [学会発表] レンサ球菌感染症の重症化機構の解明―新たな感染制御法の開発を目指して―． (2020)
  • 著者名/発表者名: 住友倫子．
  • 学会等名: 第62回歯科基礎医学会学術大会
  • 招待講演
• [学会発表] 血清型M49型Streptococcus pyogenes のCvfAは病原因子の発現と温度依存性の線毛産生に関与する． (2020)
  • 著者名/発表者名: 窪田星子，中田匡宣，広瀬雄二郎，山口雅也，住友倫子，川端重忠．
  • 学会等名: 第62回歯科基礎医学会学術大会
• [学会発表] インフルエンザに合併する細菌性肺炎の重症化機構． (2020)
  • 著者名/発表者名: 住友倫子．
  • 学会等名: 第31回日本生体防御学会学術総会
  • 招待講演
• [学会発表] 肺炎球菌のニューモライシンに依存する非血行性脳伝播機構の解析． (2020)
  • 著者名/発表者名: 高原悠樹，住友倫子，河野正充，山口雅也，中田匡宣，保富宗城，川端重忠．
  • 学会等名: 第73回日本細菌学会関西支部総会
• [学会発表] reptococcus pyogenesのCvfAと温度依存性の線毛産生機構の解析． (2020)
  • 著者名/発表者名: 窪田星子，中田匡宣，広瀬雄二郎，山口雅也，住友倫子，川端重忠．
  • 学会等名: 第73回日本細菌学会関西支部総会
• [学会発表] 化膿レンサ球菌におけるヒアルロン酸分解酵素の分子系統解析およびタンパク質結晶構造解析 (2020)
  • 著者名/発表者名: 東孝太郎，山口雅也，中田匡宣，武部克希，住友倫子，鈴木守，川端重忠．
  • 学会等名: 第43回日本分子生物学会年会
• [学会発表] emm89型化膿レンサ球菌による侵襲性感染症のゲノム配列に基づく発症機構の解明． (2020)
  • 著者名/発表者名: 大野誠之，山口雅也，広瀬雄二郎，東孝太郎，竹本訓彦，秋山徹，住友倫子，池辺忠義，山口貴弘，河原隆二，奥野ルミ，大塚仁，松本裕子，寺島祐司，賀澤優，中西典子，内田薫，秋山由美，岩渕香織，中川力，山本一成，川端重忠．
  • 学会等名: 第43回日本分子生物学会年会
• [学会発表] 交互積層細胞コーティング技術を用いた三次元肺上皮・気道モデルの構築． (2020)
  • 著者名/発表者名: 赤松由佳子，赤木隆美，住友倫子，川端重忠，明石満．
  • 学会等名: 第43回日本分子生物学会年会
• [図書] 第III編 第3章 肺炎と微生物叢．（ヒト常在菌叢と生理機能・全身疾患） (2020)
  • 著者名/発表者名: 山口雅也，川端重忠
  • 総ページ数: 325(うち7ページ)
  • 出版者: シーエムシー出版
• [備考] 大阪大学 大学院歯学研究科 口腔細菌学教室
  • URL: https://web.dent.osaka-u.ac.jp/mcrbio/