| 研究課題/領域番号 |
20K21697
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| 研究機関 | 群馬大学 |
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研究代表者 |
小湊 慶彦 群馬大学, 大学院医学系研究科, 教授 (30205512)
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| 研究分担者 |
平野 瞳子 群馬大学, 大学院医学系研究科, 技術職員 (20643810)
窪 理英子 群馬大学, 医学部, 技術職員 (40747127)
高橋 遥一郎 群馬大学, 大学院医学系研究科, 講師 (50640538)
佐野 利恵 群馬大学, 大学院医学系研究科, 准教授 (70455955)
早川 輝 群馬大学, 大学院医学系研究科, 助教 (90758575)
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| 研究期間 (年度) |
2020-07-30 – 2023-03-31
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| キーワード | OBP2B / ABO遺伝子 |
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| 研究実績の概要 |
これまで我々は、ABO遺伝子下流域の上皮細胞エンハンサー(+22.6-kb site)が上皮系細胞におけるABO遺伝子転写活性化に必須であることを明らかにした。そこで、CRISPR/Casシステムを用い、胃癌細胞KATOⅢ細胞の+22.6-kb siteを欠失させると、ABO遺伝子だけでなく、遺伝子下流のOBP2B遺伝子の発現低下が認められた。また、KATOⅢ細胞溶解液を用いたウェスタンブロットにおいても+22.6-kb site 欠失によるOBP2Bタンパクの減少を証明した。次に、OBP2B遺伝子上流域を組み込んだルシフェラーゼベクターを作製し、レポーターアッセイを行い、翻訳開始点上流の約300bpの領域がOBP2B遺伝子のプロモーター領域であることを明らかにした。また、OBP2B遺伝子プロモーターを組み込んだレポーターベクターの下流に+22.6-kbsiteを組み込むとOBP2B遺伝子プロモーター活性が上昇した。以上から、OBP2B遺伝子の転写活性化にABO遺伝子エンハンサー+22.6-kb siteが係ることが明らかになった。
上皮系細胞株であるMCF-7細胞におけるChIA-PET(クロマチン相互作用)データによると、ABO遺伝子とOBP2B遺伝子は同一のTAD内に存在する。本研究結果からABO遺伝子エンハンサーは、TAD内でOBP2B遺伝子の転写を活性化すると考えられた。OBP2B遺伝子は匂い結合タンパクをコードし、リポカリンファミリーに属する。ヒトOBP2Bタンパクは性腺や乳腺などの分泌腺で高発現し、ヒトにおける機能は明らかになっていない。TAD内で協調的な遺伝子発現調節がなされるOBP2BタンパクとABO式血液型合成酵素の機能が関連することが考えられる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
近年、クロマチンはトポロジカル関連ドメイン(Topologically Associated Domain, TAD )と呼ばれるループ構造を作り、TADの内部で離れた場所にあるエンハンサーが標的遺伝子に近接し、作用することにより転写調節がなされることが明らかとなった。上皮系細胞株であるMCF-7細胞におけるChIA-PET(クロマチン相互作用)データによると、ABO遺伝子とOBP2B遺伝子は同一のTAD内に存在する。これを踏まえ、TAD内でABO遺伝子エンハンサーが他の遺伝子発現に関与するとの仮説を立てた。
ABO遺伝子下流域の上皮細胞エンハンサー(+22.6-kb site)が上皮系細胞におけるABO遺伝子転写活性化に必須であることを明らかにした。そこで、CRISPR/Casシステムを用い、胃癌細胞KATOⅢ細胞の+22.6-kb siteを欠失させると、ABO遺伝子の発現減低下、遺伝子下流のOBP2B遺伝子の発現低下、OBP2Bタンパクの減少を観察した。OBP2B遺伝子プロモーターを特定し、そのプロモーターが(+22.6-kb siteによって制御を受けることをレポーターアッセイで確かめた。以上から、OBP2B遺伝子の転写活性化にABO遺伝子エンハンサー+22.6-kb siteが係ることが明らかになった。
本研究結果からABO遺伝子エンハンサーは、TAD内でOBP2B遺伝子の転写を活性化すると考えられた。OBP2B遺伝子は匂い結合タンパクをコードし、リポカリンファミリーに属する。ヒトOBP2Bタンパクは性腺や乳腺などの分泌腺で高発現し、ヒトにおける機能は明らかになっていない。TAD内で協調的な遺伝子発現調節がなされるOBP2BタンパクとABO式血液型合成酵素の機能が関連することが考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
下記の研究を実施する予定である。
（１）抗オドラント結合蛋白OBP2B抗体を用いた精液証明方法の確立
（２）オドラント結合蛋白OBP2Bに結合する分子種の探索：①母乳を用いて、免疫沈降法によりオドラント結合蛋白OBP2Bを分離し、それに結合する物質を質量分析により同定する。免疫沈降法によりオドラント結合蛋白OBP2Bを分離する予備実験は完了している。②同定された物質とオドラント結合蛋白OBP2Bとの結合に関わる生物物理学的な検討を行う。③同定された物質の生理学的な意義を解明する。ⅰ生殖：オドラント結合蛋白OBP2Bと結合物質の精子運動能の影響を調べる。ⅱ新生児栄養：母乳中のオドラント結合蛋白OBP2Bや結合物質の濃度を調べ、新生児の発育と比較する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
実験準備に時間を取られたこともあり、未使用額が生じてしまった。
下記の研究を実施する予定である。
（１）抗オドラント結合蛋白OBP2B抗体を用いた精液証明方法の確立
（２）オドラント結合蛋白OBP2Bに結合する分子種の探索
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