| 研究課題/領域番号 |
20K21903
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| 研究機関 | 九州工業大学 |
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研究代表者 |
安田 隆 九州工業大学, 大学院生命体工学研究科, 教授 (80270883)
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| 研究期間 (年度) |
2020-07-30 – 2023-03-31
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| キーワード | 細胞外ベシクル / 微小孔 / マイクロデバイス |
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| 研究実績の概要 |
Si製マイクロウェルの底面（膜厚約1μmの窒化シリコン（SiN）製自立膜）に直径数μmの8×8個の微小孔を形成し、この微小孔上に固定したヒトBリンパ球様細胞Ramosに対して酪酸ナトリウムを作用させることで、直径10μm以上の巨大な細胞外ベシクルを微小孔から下方に突出する形で生成することに成功した。しかしながら、一度形成された巨大ベシクルが時間の経過とともに縮小し消失してしまう問題点があった。これを解決するために、SiN膜両面への細胞膜アンカー分子の修飾条件等を見直したところ、巨大ベシクルの縮小・消失を防ぐことに成功した。予め蛍光色素DiIで細胞膜を染色しておくことでDiIを膜上に担持したベシクルを生成させ、タイムラプス撮影を行いながらベシクル生成過程を蛍光観察したところ、薬剤刺激から数時間後にベシクルの直径が10～20μmに達し、その後にその寸法が維持されることが分かった。
次に、ガラス基板表面にネガ型フォトレジストSU-8により高さ5μmのスペーサーを形成し、このガラス基板をマイクロウェル直下に設置することで、SiN膜下面とガラス基板上面の間隙を5μmに設定した。この状態でウェル内に細胞を播種しベシクルを生成させたところ、微小孔直下に突出した巨大ベシクルがガラス基板との間隙内に押し潰されるようにして広がった。そして、ウェル内の細胞をピペットで吸引して除去した後でも、ベシクルの形態は維持された。このようにして、ベシクル膜をガラス基板表面に押し広げることができたことから、ガラス基板をSiN多孔膜に置き換えることで、ベシクル膜を確実に微小孔内に保持する技術構築の見通しが立った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
研究目標を達成する上で最も重要な課題である、細胞外ベシクル膜を微小孔上に保持して、ベシクル膜表面に存在する膜タンパク質を、その構造と機能を維持した状態で微小孔内に取得する技術の確立につながる成果が得られたため。
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| 今後の研究の推進方策 |
多数のマイクロウェルをマトリックス状にアレイ化し、各ウェルの底面を構成するSiN自立膜に直径数μmの1個の微小孔を形成する。このSiN膜の直下に数μmの間隙を設けて、複数の微小孔を有する別のSiN膜を設置する。細胞及びベシクルを固定するために、上側のSiN膜両面及び下側のSiN膜上面に細胞膜アンカー分子を修飾する。マイクロウェル・アレイに適切な細胞数でヒトBリンパ球様細胞Ramosを播種し、ウェル底面の微小孔上に細胞を固定する。酪酸ナトリウムを作用させて細胞にアポトーシスを誘導することで、微小孔直下に巨大ベシクルを生成させ、下側のSiN膜内の微小孔上にベシクル膜を押し当てるようにして固定化する。その後にウェル内の細胞を吸引除去する。ベシクル膜内外の溶液の入れ替えが可能であることを、蛍光色素溶液の導入などを行うことで確認する。
次に、微小孔内に取得した膜タンパク質の機能を解析する技術を構築するために、ベシクル膜上に存在するグルコーストランスポータ1（GLUT1）を解析対象とし、GLUT1により輸送されるグルコースを検出する測定系を形成する。当初の予定通り微小孔近傍に微小電極を形成して電気化学的に測定することを検討するが、多数のマイクロウェル内またはベシクル内の微小空間を利用した同時並列的な測定を行えるメリットを活かすために、蛍光による光学的測定系の構築も視野に入れ、本解析系の有用性を実証する。
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