| 研究課題/領域番号 |
20K22574
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
藤原 良介 国立研究開発法人理化学研究所, 環境資源科学研究センター, 特別研究員 (60880797)
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| 研究期間 (年度) |
2020-09-11 – 2023-03-31
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| キーワード | 大腸菌 / 代謝改変 / グルコース / キシロース / β-アラニン / バイオプロダクション / 発酵生産 |
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| 研究実績の概要 |
大腸菌を宿主とした高効率なマロン酸生産技術の開発を目指し、昨年度に引き続きマロン酸の前駆体であるβ-アラニンの生産性向上を行った。昨年度作成したΔ7株は解糖系下流の反応であるホスホエノールピルビン酸（PEP）をピルビン酸に転換する反応（pykA, pykF, ptsHI）が破壊されている。理論上Δ7株はグルコースで増殖不可能であるが、実験結果からグルコースでも僅かながら増殖することが分かった。
そこでΔ7株に対しPhosphoenolpyruvate synthase（ppsA）の破壊を行ったところ、グルコース培地での細胞増殖能の喪失が確認された。この結果から、通常ピルビン酸からPEPを合成する反応を触媒しているPpsAが、逆方向の反応を触媒していることが示唆された。これを踏まえ、新たな代謝改変株ΔX株を作成した。ΔX株はグルコースを単一炭素源として増殖することが出来ない。ΔX株に対しWeimberg経路の導入によりグルコースキシロース混合培地においてΔX株の細胞増殖が改善することを確認した。
またΔX株は、グルコース存在下において溶存酸素濃度が低い状態では顕著に細胞増殖速度が低下することが確認された。これは細胞内にプロトンが蓄積していることが原因と考えられる。ΔX株ではグルコース代謝の過程で生産されるプロトン量が増加している一方、ピルビン酸等への炭素流入を遮断しているためプロトンの消費・排出に関わる諸反応が行われない。その結果細胞内にプロトンが蓄積し、細胞増殖が阻害されていると考えられる。
本研究でこれまでに得られた知見は、既存の代謝工学の枠を超えた新奇なものが多く、これらを踏まえた育種法を開発することで生産性の飛躍的向上が期待される。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
代謝改変株の構築は順調に進展している。一方で、既知酵素では起こらないと考えられていた逆方向の反応が確認されたことや、細胞内プロトン蓄積による細胞増殖阻害など、当初想定できなかった課題が顕在化した。
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| 今後の研究の推進方策 |
想定した代謝改変株の構築がおおむね完了したため、今後は培養条件の最適化や導入酵素の発現量の検討などを行いβアラニン及びマロン酸生産量の最大化を図る。課題として考えられる細胞内プロトン蓄積については、呼吸鎖でのプロトン排出を最大化させることで克服可能であると考えられる。そこでジャーファーメンターを利用した十分な好気条件での培養を検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
世界的な半導体不足の影響により購入希望の実験機器が欠品していたことに加え、新型コロナウイルス感染症の影響による学会参加の見送ったため。当該の実験機器については、生産状況にもよるが、本年度で購入可能であれば購入を予定している。また研究成果については感染状況を鑑みながら、オンライン発表も含めて検討する。
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