| 研究課題/領域番号 |
20K22625
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| 研究機関 | 東京医科歯科大学 |
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研究代表者 |
鈴木 博視 東京医科歯科大学, 高等研究院, プロジェクト准教授 (50635472)
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| 研究期間 (年度) |
2020-09-11 – 2022-03-31
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| キーワード | シグナル伝達 / 一回膜貫通型蛋白質 / GTPase / クライオ電子顕微鏡 / 単粒子解析 |
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| 研究実績の概要 |
本年度は、研究に適した試料作製を目指し、一回膜貫通タンパク質型受容体であるプレキシンおよびその結合相手であるセマフォリンについて他種類の遺伝子のクローニングおこない、その定性的評価をおこなった。そのため、バキュロウイルスを用いた昆虫細胞発現系および哺乳類細胞発現系の両方を立ち上げ、GFP融合タンパク質として発現させた標的タンパク質の安定性を蛍光ゲル濾過法により評価することで、全長での安定な大量発現が可能なプレキシンの候補遺伝子を複数同定した。セマフォリンに関しては細胞外領域の後ろに膜貫通領域を有するタイプも存在するため、それらを保持したものと欠損させたもの両方を検討し、細胞外領域のみを含む欠損体の方が発現量・安定性ともに向上する傾向が見られた。
主に哺乳類細胞系による大量発現をおこない、抗GFP抗体を用いたアフィニティー精製とゲル濾過カラムクロマトグラフィーを組み合わせることで高純度のプレキシンおよびセマフォリンを精製することができた。これらはそれぞれネガティブ染色法による電子顕微鏡観察をおこない、その試料の単分散性を確認することができた。プレキシン-セマフォリンの複合体形成に関しては、その結合親和性が弱いと最終ステップでのゲル濾過クロマトグラフィー時に複合体が乖離する傾向が見られたため、親和性の高い組み合わせを用いたり複合体を安定化させる修飾を施したりすることが複合体精製において重要であることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
遺伝子のクローニングから開始し、発現スクリーニング系を立ち上げて安定な標的タンパク質を同定することができた。それをもとに、初年度の見込み通りに複数種の安定なタンパク質の発現・精製系を確立することができたため、本研究計画が順調に進捗しているといえる。
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| 今後の研究の推進方策 |
精製したセマフォリンとプレキシンの複合体形成条件を最適化し、ネガティブ染色法を用いた電子顕微鏡観察によってその動的な構造変化を低分解能において評価する。また、精製した全長プレキシンを擬似的な膜環境である脂質ナノディスクに再構成するする条件検討をおこない、セマフォリン結合時の構造をより生体内に近い条件にすることで、クライオ電子顕微鏡により適した試料調整を目指す。結合親和性の検討に関しては、表面プラズモン共鳴法による定量的測定系を立ち上げを目指す。
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