| 研究課題/領域番号 |
20K22631
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
好岡 大輔 大阪大学, 医学系研究科, 助教 (00883084)
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| 研究期間 (年度) |
2020-09-11 – 2023-03-31
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| キーワード | 1分子イメージング / 神経可塑性 / 軸索起始部（AIS） / イオンチャネル / PIP2 / 脂質ドメイン / エンドサイトーシス / エキソサイトーシス |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、神経におけるイオンチャネルの非対称的な空間パターンに着目し、その空間パターンとPIP2の連関を明らかにすることを目的とする。これまでに、蛍光標識用タグ（Haloタグ）を融合させたKCNQ2、KCNQ3、GABAA受容体、グリシン受容体の作成を既に完了している。本年度はまず、全細胞パッチクランプ法により、これらHaloタグ融合イオンチャネルが正常なイオンチャネル活性を保つことを確認した。次に、リポフェクション法を用いてこれらHaloタグ融合イオンチャネルを海馬神経細胞に遺伝子導入し、共焦点顕微鏡によりイメージングした。細胞膜非透過性、透過性Haloタグリガンド（Alexa Fluor 660、TMR）を用いて２色同時染色することにより、細胞膜と細胞質に存在するHaloタグ融合KCNQ3分子を染め分けることができた。これにより、先行研究で示されている通り、Haloタグ融合KCNQ3が軸索起始部の細胞膜表面に集積した特徴的な空間パターンを示すことを確認できた。さらに、この神経細胞を対象として１分子イメージングを実施したところ、細胞体、樹状突起、軸索起始部といった細胞領域ごとにKCNQ3の１分子動態を計測することにも成功した。輝点追跡によって得られた拡散軌跡を隠れマルコフモデルに基づいて解析し、膜上に見える輝点の拡散係数や寿命・出現頻度を算出した。これにより、イオンチャネルの側方拡散動態やエンド・エキソサイトーシスを定量化することができた。
以上のように、本年度は海馬神経細胞におけるイオンチャネルの動態計測に必須となる一連の実験系の基礎を確立することができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究では細胞内のPIP2レベルを操作し、それによって引き起こされるイオンチャネルの空間パターン変化を調べることを最終目的としている。本年度はその前段階として、神経細胞内で定常状態にあるKCNQ3の１分子動態を計測するための実験系を確立することに成功した。これに加え、PIP2レベルを人為的に操作するための実験条件が整えば、本研究課題の目的を達成することができると考えている。現在、ムスカリン受容体の下流シグナル経路を活性化させるコリン作動薬（カルバコール）を用いて、AIS再編成を誘導できる実験条件の検討を進めている。
また並行して、PIP2結合親和性がKCNQ3の空間動態に及ぼす影響を調べるために、KCNQ3が持つ複数のPIP2結合サイトに変異を導入した。これによりイオンチャネル活性が多段階に変化したKCNQ3変異体を得ることができた。興味深いことに、これら変異体を発現させたHEK293細胞を用いた予備実験では、既にKCNQ3の活性と拡散動態の間に負の相関が見出されている。今後、これら低PIP2親和性KCNQ3を海馬神経細胞にも発現させることで、PIP2―KCNQ3間相互作用がKCNQ3のAIS局在に及ぼす効果も検証できると考えている。
上述の通り、研究をおおむね計画通りに進行することができている。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は本年度に引き続き、コリン作動薬（カルバコール）を用いたPIP2操作の条件検討を進めるとともに、AISマーカーであるNav1.2のⅡ－Ⅲリンカーを融合したVSPの作成を試み、AIS局所的なPIP2操作に取り組む。そして、野生型および低PIP2親和性KCNQ3を発現した海馬神経細胞を対象として共焦点、１分子イメージングを実施し、PIP2がイオンチャネルの時空間動態に与える影響をより詳細に調べる。最終的には、薬理学・電気生理学的にPIP2レベルを操作した時に、どのようにイオンチャネルの空間パターン再編成が生じるのか、またその変化にどのような生理的意義があるのか数理的に理解することを目指す。
上述の通り、今後、遂行する研究内容は基本的に当初の研究計画に従っており、大きな変更点はない。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本研究の遂行のために必須となる海馬神経の初代培養系の立ち上げに予定よりも期間を要したことや、パンデミックの影響により学会がオンライン開催となったこと等により、次年度使用額が生じた。次年度においては、継続的に神経細胞培養を行うために必要な消耗品、薬理学実験やイメージング計測で扱う試薬のために予算を使用する。また、これまでに得られた成果を発表するためにも予算を使用する予定である。
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