| 研究課題/領域番号 |
20K22722
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| 研究機関 | 東京農業大学 |
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研究代表者 |
宮下 慎一郎 東京農業大学, 生物産業学部, 助教 (20883292)
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| 研究期間 (年度) |
2020-09-11 – 2022-03-31
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| キーワード | 神経細胞変性疾患 / 凝集タンパク質 / ペプチド製剤 / ドラッグデリバリー / ボツリヌス神経毒素様毒素 / 無毒化神経毒素 |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、無毒化した細菌毒素を用いた非ウィルス系ドラッグデリバリーシステムの開発である。キャリアーとしてボツリヌス神経毒素様毒素およびボツリヌス神経毒素をベースとした無毒化キメラ毒素（ciBoNT/XA）を用い、抗体あるいはペプチド製剤を神経細胞内に送達することを目標とする。令和2年度は、①ペプチド製剤を連結したciBoNT/XAタンパク質の組換えタンパク質の発現および精製、②培養細胞を用いた評価系構築に取り組んだ。
①. 病原性タンパク質の凝集を抑制するペプチドを先行研究から選択した。ciBoNT/XAのN末端側にペプチドを直接連結したコンストラクトを作製した。大腸菌を用いたタンパク質発現系を構築し、クロマトグラフィーによりペプチド-ciBoNTを精製した。タンパク質収量は以後の実験に供するだけの十分量を得た。
②. ciBoNT/XAにより、連結されたペプチドが神経細胞内に送達されるか、さらに送達されたペプチドがターゲットタンパク質の凝集を抑制できるか調べるために培養細胞を用いた評価系構築に取り組んだ。神経細胞において凝集体を形成するタンパク質遺伝子を含むプラスミドをヒト神経芽細胞腫培養細胞にトランスフェクションした。蛍光顕微鏡を用いた細胞観察により、病原タンパク質の凝集体が観察された。今後、ペプチド-ciBoNT/XAの効果を凝集タンパク質発現細胞モデルを用いて評価する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
令和2年度は予定通り、ペプチド製剤を連結した無毒化キメラ毒素タンパク質の精製および神経細胞変性に関与する病原性タンパク質を発現する細胞モデルの構築を行った。
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| 今後の研究の推進方策 |
凝集タンパク質発現細胞モデルを用いて、ペプチド製剤-ciBoNT/XAのタンパク質凝集抑制活性について調べる。ペプチド製剤にタンパク質分解を誘導するデグロン配列を付加し効果を検証する。ペプチドの他に、各種抗体（VHH、scFv）あるいはゲノム編集ツールをciBoNT/XAに連結し、送達効率を比較することでciBoNTが効果的に送達できるタンパク質性医薬品の種類あるいはサイズを明らかにする。
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