| 研究課題/領域番号 |
20K22728
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| 研究機関 | 愛知学院大学 |
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研究代表者 |
篠田 知恵 (坪井知恵) 愛知学院大学, 薬学部, 助教 (70736355)
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| 研究期間 (年度) |
2020-09-11 – 2023-03-31
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| キーワード | 脂肪酸 / アルツハイマー病 / ミクログリア / 核内受容体 / プレクリニカル |
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| 研究実績の概要 |
脂質異常症はアルツハイマー症（AD）発症の危険因子である。加齢やストレスに起因する中枢のミクログリアの活性化による炎症反応がAD発症を誘発すると考えられるようになってきたことから、「脂質代謝の変調」による「ミクログリアの活性化」がAD発症に先駆するのではないかと考えた。
ミクログリア細胞株としてBV2細胞を用いて実験した。脂質代謝の変調として、飽和脂肪酸であるパルミチン酸（PA）200 μMを用いたところ、IL-1β、TNFα、COX2、IL-6のmRNA発現の上昇や脂質代謝関連因子ABCA1の抑制がみとめられた。PA誘導による炎症反応がどのような経路を介しているのかを調べる為に、小胞体ストレス関連因子（Atf4、Chop、Cas12）のmRNA 発現を調べたところ、PA はAtf4、Chop、Cas12のmRNA発現を上昇させたことから、PAによって小胞体ストレス反応が惹起され、アポトーシス誘導が促進される可能性が示された。RXRアゴニストであるBexarotene（BEX）をPA と同時に添加したところ、PA によるTnfα、Il-1β、Il-6、Cox2、Atf4、Chop、Cas12 mRNA 発現の増加が抑制された。この効果を検証する為にRXRアンタゴニストを用いたところ、BEX によるTnfα mRNA 発現抑制効果が消失したことから、PA 誘導による炎症反応や小胞体ストレスは、RXRを介して抑制されると考えられた。
今後、RXRアンタゴニストだけでなくRXRノックダウン細胞株を樹立して用いることでPA誘導による炎症反応におけるRXRの重要性を示していくと共に、PAにおける抗炎症反応について貪食作用や抗酸化作用について調べる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
交付当初の「新型コロナウイルス感染症緊急事態宣言」に伴い日本学術振興会への申請書提出期限が１ヶ月延長となっただけでなく、交付決定の遅延もあり入金が予定よりも半年以上遅れていた。また、同理由で今年度も学生の学内への出入りの制限があっただけでなく、物流の制限もあったことから消耗品購入に制限がかかったことから実験に遅れが生じていた。
また、当初実験で使用しようと計画していたRXRαのshRNAのノックダウン効率が非常に悪く、条件検討に時間がかかってしまたこと、またshRNAを再度購入するだけでなく大腸菌を起こし直すところから再実験を試みた為更に時間がかかってしまった。更にRXRアンタゴニストの検討を行ったがアンタゴニストそれ自体で抗炎症作用が見られてしまうものもあり、アンタゴニストの選定にも時間を有した。
以上のことから本研究の進捗はやや遅れている。
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| 今後の研究の推進方策 |
BV2細胞を用いて以下の実験を行う。
＜１＞PA誘導細胞内炎症に対する核内受容体アゴニストによる改善効果を調べる。：RAR、RXRの各アゴニストの抗炎症作用しか未だ調べていない為、更にPPARsのアゴニストによる抗炎症作用や脂質代謝関連因子のmRNA・タンパク質に及ぼす効果を明らかにする。
＜２＞PA誘導による貪食能やオートファジーの変化を調べる。：今年度、マクロファージ様細胞RAW264.7細胞を用いて蛍光ビーズを用いた貪食能測定の為の予備実験を行った。しかし、ビーズの取り込み方法については更なる条件検討が必要である。今後、その条件や方法を確立するのと併せ、PA添加によって貪食能ならびにオートファジーにどのような影響があるのかを蛍光測定法、FACSなどで評価する。
＜３＞１の結果、核内受容体アゴニストを介した抗炎症作用のメカニズムを調べる。：RXRアゴニストの前処理ならびに同時添加によって抗炎症効果が認められている。この細胞保護効果がPA誘導による炎症反応のどの段階に働きかけるのかを検討する為、RXRアンタゴニストを用いるだけでなくRXRノックダウン細胞株の樹立を目指す。今年度、条件検討を行ったがノックダウン効率が決して高いとは言えない。更に条件検討を進める。
＜４＞天然由来核内受容体アゴニストの探索：今までに、天然由来RXRアゴニストとして単離精製したプレニルフラバノンSPF1と2が、神経細胞様PC12細胞の抗炎症作用を示すと共に、ABCA1発現を増加させAβによる神経毒性を抑制している可能性を報告してきた。これらの知見より、天然由来アゴニストはABCA1発現増加作用及び脂質代謝の改善に働く可能性があり、活性化ミクログリアに対する天然由来核内受容体アゴニストを用いた機能改善効果の検討を試みると共に、生薬成分からの新規天然由来核内受容体アゴニストの探索も試みる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初計画と使用額は予定通りであったが、初年度に半年遅れた入金分を埋めるだけの実験が計画できなかった。それは、今年度も新型コロナウイルスによる消耗品購入に制限がかかったことも理由として挙げられる。更に新型コロナウイルス感染防止の為に学会が全てオンライン化したことによって国内旅費の必要がなくなったことから、使用額が計画より遅れている。
次年度は、今年度に購入できなかったタンパク質発現を調べる為の一次抗体の購入を行うだけでなく、ELISAキットの購入も進めていきたい。
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