2021 年度実施状況報告書

内在性MSCsの免疫調節能障害メカニズムの解明とインプラント周囲炎の新規治療戦略

研究課題

研究課題/領域番号	20K23109
研究機関	岡山大学
研究代表者	黄野頂策岡山大学, 大学病院, 医員 (60882644)
研究期間 (年度)	2020-09-11 – 2023-03-31
キーワード	間葉系幹細胞 / 慢性炎症性疾患 / インプラント周囲炎
研究実績の概要	口腔インプラント治療は欠損機能回復法のひとつとして広く定着した。その一方でインプラント周囲炎による歯槽骨破壊が大きな社会問題となっている。インプラント周囲炎の発症メカニズムは未だ解明されておらず、抜本的な治療法の開発が急務である。申請者らは、慢性炎症性疾患である歯周病の組織破壊に、内在性間葉系幹細胞(MSCs)の免疫調整能の低下が関与している可能性を見出した(Aung et al., 2020)。本研究課題の解決のため、本年度は、マウスインプラント周囲炎モデルの作製及び同モデルのHE切片の作製及びマイクロCTでの解析を行った。また加齢や個体差によるMSCsの免疫調整能の低下が、インプラント周囲炎における骨組織破壊を引き起こす機序を解明することを目的として50周齢マウスに対して同様のインプラント周囲炎モデルの作製を行なった。今年度は前年度に引き続き、採取されたサンプルのHE、Masson tricrome染色を含めた組織学的解析及び、CTと組織学的解析より得られた情報を統計学的に解析した。本年度は更なるサンプルの追加と安定したモデルの作成及びMSCs可視化(Cxcl12-GFP)遺伝子改変マウスを用いたモデルの作成を予定していたが、同個体の入手困難及び、インプラント体が入手困難となり研究が滞っている状態である。またマウスにおけるインプラント周囲炎モデルの作成には成功したが、モデルの作成が安定せず、また現在のインプラント体のデザインでは、計測に不安定な部位があるためデザインの変更を予定している。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 4: 遅れている理由新型コロナウィルスの影響により、一部材料の入手が困難になっているため、また当初予定していた実験体の入手が困難になったため。またインプラント体のデザインの変更、実験体の入手困難による実験系の変更が必要になったため。
今後の研究の推進方策	今後の研究の推進方策としてはマウスのサンプル数を増やし，Cxcl12-GFPマウスの代替案として今後得られるサンプルにおいてCxcl12を用い蛍光免疫染色にてCxcl12陽性細胞の分布を調べる。またインプラント体及び実験デザインを変更する。(5週齢C57BL/6Jマウスの上顎第一臼歯を抜歯し，3週間の骨治癒後に実験用のチタン製擬似インプラントを埋入し，骨結合獲得(3週間)を待つ.骨結合確認の後，LPSを埋入組織周囲に注射することで骨吸収を誘導する.尚，注射しない群をネガティブコントロール群とし, PBSのみを注射した群をコントロールとし、PBSの影響により骨吸収が誘導されていないことを確認する.骨吸収誘導後7,13,20,27日経過時点で屠殺し，上顎骨を回収する.マイクロCTによる骨吸収量の測定および凍結切片を作製し，Cxcl12,PDGFrα.CD3陽性T細胞，B220陽性B細胞の分布を確認を蛍光免疫染色にて確認し，MSCsの分布との関連性を明らかにする.破骨細胞の分布は脱灰後にパラフィン切片を作製し，TRAP染色により確認する.炎症を惹起しないコントロール群と経時的に比較する.またインプラント周囲炎モデルを，週齢の異なる50週齢でも同様に作製し，歯槽骨破壊程度をマイクロCTによる骨形態計測で，MSCsの集積，炎症性細浸潤，破骨細胞形成程度を組織学的細胞数カウントにより比較する.若齢群と加齢群のインプラント周囲炎の肉芽組織をサンプリングし，Cxcl12陽性細胞であるMSCsをソーティングし回収する.まず，免疫調節能に関係することが知られている遺伝子(TGF-b, IL-2, IL-10, MCP-1, FASL等)の発現レベルを比較する.次に，これらの遺伝子発現の差を網羅的に解析するためにRNAseqで比較する.また，明確に差があった原因遺伝子を若齢マウスMSCsでsiRNA等によりノックダウンすることにより，50週齢MSCsの免疫調節機能の低下が誘導されることを確認し，免疫調節に関係する責任遺伝子を同定する.
次年度使用額が生じた理由	新型コロナウイルスの影響により、一部材料の入手が困難になっているため、また当初予定していた実験体の入手が困難になったため。またインプラント体のデザインの変更、実験体の入手困難による実験系の変更が必要になったため次年度使用額が生じた。次年度に行う予定であるマウスインプラント周囲炎モデルの作成及び、インプラント体の作製、免疫染色等で必要となる試薬等の費用に充当する。