| 研究課題/領域番号 |
20KK0157
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| 研究機関 | 公益財団法人東京都医学総合研究所 |
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研究代表者 |
正井 久雄 公益財団法人東京都医学総合研究所, 基礎医科学研究分野, 所長 (40229349)
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| 研究分担者 |
森山 賢治 公益財団法人東京都医学総合研究所, 基礎医科学研究分野, 研究員 (00250217)
井口 智弘 公益財団法人東京都医学総合研究所, 基礎医科学研究分野, 研究員 (10783516)
加納 豊 公益財団法人東京都医学総合研究所, 基礎医科学研究分野, 主席研究員 (90450593)
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| 研究期間 (年度) |
2020-10-27 – 2025-03-31
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| キーワード | Rif1 / オリゴマー / グアニン四重鎖 / 電子顕微鏡 / 単粒子解析 / クロマチンループ / テロメア / シェルタリン |
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| 研究実績の概要 |
当初、G4（グアニン四重鎖）DNAと全長Rif1オリゴマーとの複合体の微細形態をクライオ電子顕微鏡による単粒子解析で決定することを目指し、マウスRif1（2,418アミノ酸）、及び分裂酵母Rif1（1,400アミノ酸）の大量精製に着手した。しかし、両者とも全長タンパク質として大量精製することは非常に困難であった。そこで、ヒトRif1の精製を試みた。monoQカラムなどと組み合わせ、比較的濃度の高い標品を得ることができた。マウスRif1についてN末端領域（NTD, 1,151アミノ酸）とC 末端領域（CTD, 299アミノ酸）の間にある長い天然変性領域（LID, 968アミノ酸）を欠失させたRif1-NC（NTD+CTD）を293T細胞から大量精製した。また、ヒトRif1-NCの精製を進めた。Huilin Li 教授のラボでこれらの電顕観察・単粒子解析を実施している。また、これらの標品を用い高速AFMによりその分子動態を解析した。
N末端92アミノ酸を欠失させた分裂酵母のRif1を精製し、現在Huilin Li 教授のラボで電顕観察・単粒子解析を進めている。
分裂酵母及びヒトRif1のC末端領域ポリペプチドのみでテトラマー（四量体）を形成し、G4にも結合する。これらのポリペプチドを大腸菌で大量精製し、Cryo観察やAFM解析を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
マウスRif1も分裂酵母Rif1も、全長タンパク質として高度、かつ、大量に精製することは非常に困難であり、これが研究の進捗に遅れが出た主な要因である。また、内在的な不安定性を有しており、分解産物を除去するのが困難であったことも進歩を遅らせたた主な要因である。そのため、種々の変異体をデザイン、作製し、安定性の高いポリペプチドを精製するという努力が必要であった。今年度、ヒト全長Rif1、および天然変性領域(LID)を欠失させたRif1-NC（NTD+CTD）の精製を行った。精製されたタンパク質をまず高速AFMで解析したところ、NTDおよびCTDおよびそれを結びつけるLIDの糸状分子が観察された。NTD及びCTDは、ダイナミックにその位置関係を変化させていることが明らかになった。一方、Rif1-NCは、ダイナミクスを喪失し、NTDおよびCTDが一定の位置に存在した。
これらのタンパクを用いクライオ電顕による観察を継続するとともに、Rif1C末ポリペプチドを大腸菌から大量精製し、結晶化・構造解析を進めている。
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| 今後の研究の推進方策 |
1) マウスRif1-NCオリゴマーの分子形態の確定には至らなかったが、最近、マウスよりもヒト全長Rif1、Rif1-NCの方が293T細胞での発現効率が良いことが判明したため、その大量精製を進めた。これらのタンパク質が十分に精製でき次第、電顕観察・単粒子解析に供する。
2) また、N末端92アミノ酸を欠失した分裂酵母Rif1、及び、そのC末端のテトラマー形成ドメインについては、現在Huilin Li 教授のラボで電顕観察・単粒子解析を進め、また、九州大学の神田大輔教授と共同で結晶化、X線構造解析を進める。
3) Rif1の分子動態は、その核内染色体構造の制御と大きく関連すると思われる。高速AFMによるRif1のダイナミクスの解析をG4 DNAやリン脂質の存在下で行う。
4) IDP領域はリン酸化など種々の修飾を受ける。これらの修飾が分子動態に与える影響を高速AFM観察で明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
2500アミノ酸におよぶサイズの大きいRif1タンパク質は、増産の効率、分解などの問題のため、解析に適した精製度を有するタンパク質を十分量得ることが難しかった。また、コロナ禍で、実験遂行に障害が出て、構造解析が思った速度で進まなかったため解析費用充当分に未使用額が生じた。
今後、さらに全長Rif1も含めて、種々の変異体を作製して、それらを大量精製するために、組換えDNAのための試薬、DNA精製のキット、 血清、培地、タンパク精製のためのレジンなどの購入に充てる。また、状況が許せば、Li博士を訪問し、構造解析の実験を遂行する。そのための旅費、滞在費にも充てる。
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