| 研究課題/領域番号 |
20KK0178
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| 研究機関 | 金沢大学 |
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研究代表者 |
島上 哲朗 金沢大学, 附属病院, 特任教授 (50436820)
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| 研究分担者 |
村居 和寿 金沢大学, 保健学系, 助教 (10828099)
善岡 克次 金沢大学, がん進展制御研究所, 教授 (60200937)
山下 太郎 金沢大学, 附属病院, 准教授 (90377432)
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| 研究期間 (年度) |
2020-10-27 – 2024-03-31
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| キーワード | D型肝炎ウイルス |
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| 研究実績の概要 |
1.レポーター遺伝子HiBiTを利用したリコンビナントD型肝炎ウイルスの作成と抗ウイルス薬スクリニーニング：D型肝炎ウイルス（以下HDV）のsmall delta蛋白質中に11アミノ酸のHiBiT遺伝子を挿入したリコンビナントHDV（rHDV）を作成した。rHDVを肝がん細胞株に遺伝子導入したところ、細胞内での複製を認め、さらに培養細胞中及び細胞上清中で充分なHiBiT活性の検出が可能であった。すなわちHiBiT活性を指標とすることでハイスループットなHDVの抗ウイルス薬のスクリーニングが可能となった。この系を用いて、約770の薬剤を有するFDA承認薬ライブラリーに関して1stスクリニーニングを行い、複数の抗ウイルス効果を有するcompoundsを同定した。
2.モンゴルにおけるヒト肝がん組織由来RNAのRNAseq解析：これまでのモンゴルとの共同研究から、HDVとB型肝炎ウイルス（以下HBV）が共感染者の肝がん組織由来RNA、HBV単独感染者の肝がん組織由来RNAを計約50例分、すでに金沢大学へ送付を受けている。これらのRNAに関してRNAseq解析を行い、HDVとHBV共感染者の肝がん組織特異的に、複数の融合遺伝子を同定した。
3.モンゴルにおけるヒト肝がん組織と血液の採取：モンゴルの共同研究者（モンゴル国立医科大学のDuger教授）は、モンゴルにおいて肝がんに対して手術療法を受けた患者の肝組織の残余検体からRNAを抽出し、保存している。また肝がんの手術療法をうけた患者の血液を保存すると共に、肝画像所見、腫瘍マーカーを含む血液生化学データや臨床情報の収集、予後の追跡を行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
初年度、HiBiTを利用したリコンビナントHDVの作成やこの系を用いたHDVに対する抗ウイルス薬のスクリーニング、およびモンゴルのヒト肝がん組織のRNAを用いたRNAseq法による網羅的遺伝子解析を行うなど概ね順調に進行している。本来であれば、研究代表者がモンゴルを訪問し、モンゴルにおいてヒト肝組織からのRNA抽出法をモンゴルの共同研究者と共に実施する予定であった。しかし、新型コロナウイルスの感染蔓延によりモンゴル訪問は困難であったため、RNA抽出法の共有により代替した。現時点では、モンゴルにおいても純度の高いRNAの抽出ができている。研究代表者のモンゴル訪問により、モンゴルにおいてHBV・HDVの培養肝細胞感染系を用いた研究基盤の確立を行う予定であった。しかし、モンゴル訪問ができていないためこの目的は未達成である。
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| 今後の研究の推進方策 |
1.HiBiTを用いたrHDVウイルスの改良：初年度作成したrHDVは、肝がん細胞株中で複製することを確認したが、感染性粒子の産生は確認できなかった。そのため、現在のrHDVではHDVの全生活環をモニタリングすることができない。感染性粒子産生ができない理由として、HiBiTの挿入により感染性粒子産生に必須なlarge delta蛋白質の発現が抑制されている点が挙げられる。この課題を解決するために、HiBiT遺伝子の挿入部位を変更する、現在用いている一倍長のウイルスゲノムの代わりにより複製能が強い三倍長のウイルスゲノムを用いる、large delta蛋白質を安定的に発現する肝がん細胞株を作成する、などの解決策を試す予定である。これらの方法により、感染性粒子産生を含むHDVの全生活環をHiBiT活性でモニタリング可能なrHDVを作成する。また初年度にFDA承認薬ライブラリーのスクリーニングを用いた1st screeningから抽出したHDVに対する抗ウイルス効果を有することが示唆されたcompoundsに関して2nd screeningを実施し、抗ウイルス薬となりうるcompoundsを同定する。
2.モンゴルにおけるヒト肝がん組織由来RNAのRNAseq解析：初年度の解析から同定した、HDVとHBV共感染者の肝がん組織特異的に、複数の融合遺伝子に関して、それぞれ、培養細胞過剰発現用ベクターにクローニングする。さらにこの融合遺伝子発現ベクターを培養細胞に遺伝子導入し、機能解析を行う。機能解析として、形質転換能、細胞増殖能、コロニー形成能、腫瘍形成能、抗がん剤感受性、血管新生能を評価する。
3.モンゴルにおけるヒト肝がん組織と血液の採取：引き続きヒト肝がん組織由来RNAの抽出と保存、血液の保存および臨床データの収集を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
R2年度にモンゴルを3回訪問し、共同研究を行う予定であったが、新型コロナウイルス感染拡大のためモンゴル訪問ができなかった。またD型肝炎ウイルスが複製する肝がん細胞株、ヒト肝細胞由来RNAを用いたRNAseq解析による網羅的遺伝子解析を行う予定であったが、D型肝炎ウイルスのこれらの細胞での複製効率が低いため、R2年度は解析を行わなかった。そのため当該助成金が発生した。R3年度は、新型コロナウイルス感染状況をみて可能であればモンゴルを訪問する。また現在、D型肝炎ウイルスの培養細胞への複製効率の改善を行っており、高効率の複製を認めた後に、R2年度実施予定であったRNAseq解析による網羅的遺伝子解析を行う予定である。こらの旅費および解析に当該助成金を用いる予定である。
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