| 研究概要 |
本年度において、LacO-LacIレポーターシステムによる免疫沈降からDNA/タンパク複合体のMS解析を実施可能かどうかの先行実験として、タグ配列(LacOリピート)を有するプラスミドの免疫沈降とプラスミドに集積する複合体タンパクのMS解析を行った。LacO/LacIシレポーターステムによる免疫沈降産物をPCRにより評価した結果、
LacO/Laclレポーターシステムを用いた免疫沈降産物では非特異的抗体を用いた免疫沈降産物と比較し、明瞭なバンドが確認できた。この結果よりLacO/LacIレポーターシステムによってタグ配列を有するプラスミドを特異的に回収できたことを示唆する。その免疫沈降産物のMS解析を行った結果、タグ配列に特異的に集積するLac/タンパクの検出に成功した。このことは、MS解析によりプラスミド上のタグ配列に集積したDNA/タンパク複合体を検出したことを示唆し、DNA配列に集積した複合体をLacO/LacIレポーターシステムにより免疫沈降し、MS解析により同定可能であることを示唆する。また並行してChrIP法の解析に用いる資材の構築に成功した。DNA/タンパク1機能性RNA複合体をターゲットとするXISTおいてはXIST RNAをコードしているBAC由来ゲノム領域をintegraseを用いてタグ配列を有する人工染色体上に搭載させた。また疾患由来反復配列をターゲットとするCGGリピートにおいては(CGG)100リピートを保因者DNAよりPCRクローニングし、制限酵素サイトを用いてタンデム化を行ったリピートを(CGG)100x1,x2,x4,x8の4パターンのプラスミドを作製した。その後タグ配列を有する人工染色体上に搭載させた。搭載させたリピート配列はサザンプロットにより確認した。またFISH法により人工染色体の存在を確認した。
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