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平成21年度までに、RNAのステム構造に含まれるGGミスマッチに結合する小分子リガンド(NCTX)についての基本的な結合物性(結合能、選択性、評価法)を明らかにした。本年度は、核酸二次構造変化の顕微鏡観測と、いくつかの機能性RNAを標的として、RNA結命分子NCTXによる翻訳過程の制御を試みた。
RNAのリガンド結合に伴う二次構造変化を像として確認するため、原子間力顕微鏡による評価を行った。DNAで行ったモデル実験により、DNAミスマッチの二次構造変化を本法により可視化できることを確認した。続いて、研究計画に従い、mRNAを標的として選び、天然に存在するリボスイッチ同様、小分子リガンドによる翻訳の制御を試みた。レポータータンパク質としてルシフェラーゼをコードするmRNAを用い、5'の非翻訳領域において種々配列設計を行った。非翻訳領域にリボソーム結合部位を含む形で、NCTXの結合サイトであるGGミスマッチを導入した。GGミスマッチの導入位置、個数、周辺配列を様々に変えた配列をPCR法を用いて合成し、それぞれのルシフェラーゼ発現量を化学発光強度により評価した。その多くの配列について、NCTXリガンドの結合による翻訳量の抑制が確認されたが、その変化幅や発現の絶対量に配列ごとに差異があり、いくつか最適な配列を選択することに成功した。リガンド結合部位を5'非翻訳領域に持たないmRNAは、リガンドの濃度に応じて翻訳量変化がほとんど失われたことから、リガンド選択的に翻訳制御されたことが示唆された。この翻訳抑制が意図したようにNCTXリガンドの結合により進行しているかどうかを確認するため、NCTXのmRNA上での結合位置をゲル電気泳動を用いて解析を行い、導入した結合サイトに実際に結合していることを示すデータを得た。さらに外部刺激である光による制御を評価検討中である。
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