| 研究概要 |
蛍光相関分光法は単1分子感度の高感度でかつ原理的に単純である反面,特定の1点でしか測定できないことが細胞生物学的応用に置ける大きな問題点である。それを解決するため3次元多点同時測定FCSの構築を行い,細胞内の任意の空間における分子複合体の形成・タンパク質相互作用等を検出し,機能性分子の挙動と細胞機能を結びつけることが可能なシステムを開発することを目指している。本年度は空間位相変調素子(SLM)によるマルチレーザービーム作成と多点における相関シグナルの同時検出を行った。1つのレーザー光を多数のレーザービームにするためにプログラム可能な変調素子を利用して構築した。最初の検討目標として3x3としたが,検出器に用いる光ファイバーの数と安定性から7点とした。つまりひとつの円を6つの円で囲む形である。各々励起点からの蛍光シグナルと効率的に検出するための空間配置をSLMを用いて決定し,さらにそのホログラム像を重ねあわせ法を用いて計算し,7点照射のパターンとした。7点同時励起ならびに同時蛍光相関検出を行い,単1分子感度にて,標準色素であるローダミン6Gの溶液内拡散速度,ならびに,生細胞内におけるGFPの拡散速度の測定に成功した。その拡散速度はこれまで測定値よりやや大きいものの形状ファクターはこれまでと同程度であることから十分な精度と感度を有していることが分かった。生細胞においてはガラス接着面から0.5ミクロン置きに相関カーブが検出できることを確認し,細胞質ならびに核を区別しての測定が可能であることを実証した。
さらに,7点同時測定が可能になったことから測定点間の空間相関の検出を行ったところ,モデル実験であるが,分子の移動方向にはポジティブシグナル,また反対方向にはネガティブの空間相互相関信号が検出された。これまでの時間相関に加えて,新たに空間相関解析が可能であることを実証した。
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