| 研究課題/領域番号 |
21227003
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| 研究機関 | 兵庫県立大学 |
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研究代表者 |
月原 冨武 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 特任教授 (00032277)
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| 研究分担者 |
山下 栄樹 大阪大学, たんぱく質研究所, 助教 (00294132)
田中 秀明 大阪大学, たんぱく質研究所, 助教 (40346169)
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| 研究期間 (年度) |
2009-05-11 – 2014-03-31
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| キーワード | 超分子 / 蛋白質 / 立体構造 / X線結晶構造解析 / 膜タンパク質 / 輸送 |
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| 研究概要 |
高等な生物では、特定の分子を働くべき場所に輸送する仕組みがあり、そのことによって高度に制御された生命の営みが可能になっている。こうした輸送に関わる生体超分子の立体構造を決定して、その働きの仕組みを明らかにするのが本研究の目的である。細胞間輸送ではギャップジャンクション、細胞質から細胞外排出及び核内への輸送ではボルト、核外への輸送ではイクスポーティンを研究対象に取りあげている。
小RNAの核外輸送に関わる、Exportin-5の研究では、Exportin-5・RanGTP・Pre-microRNA３者複合体の、Exportin-5・RanGT2者複合体の結晶構造解析に加えて、Exportin-5単体の結晶化に成功した。
細胞内での輸送に関わると考えられているボルトは分子量が10MDaを超える巨大な粒子である。ボルトの39量体構造を形成するのに重要と思われるC末端領域の構造が未知である。そのためには３Åを越える分解能の結晶を得る必要がある。ラット肝臓のボルトに加えて昆虫細胞の発現系でボルトの調製法を確立した。昆虫細胞発現系によってフレキシブルなMVPのN末端（粒子ウェストを形成）をロイシンジッパーで固定化した組み換えボルトを調製して、昆虫細胞1L培養あたり80mgの高純度ボルト粒子（LZ-ボルト）を得る事が可能となった。その結晶化にも成功して高分解能回折強度データを収集している。
ギャップ結合チャネルの構造に基づいて、半チャネルが細胞間でドッキングしてチャネルを形成する機構を明らかにする研究を行った。ホモロジーモデリングに基づいた変異体を調製して、機能解析と光学顕微鏡観察によってチャネル形成を解析した。その結果、チャネル形成に重要なアミノ酸残基および相互作用様式を明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
イクスポーティンは当初目標を超過達成している。ボルトは3オングストロームを越える分解能で構造決定をして、構造未確定の部分の構造を決定することを目指している。そのために組み換えボルトの大量調製に成功して、3オングストロームを越える分解能の回折像を確認した。4オングストローム分解能の結晶を調製するところまで来た。ボルト、ギャップ結合チャネル共にまだ5年間の目標を達成していないが、おおむね順調に進展していると言える。
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| 今後の研究の推進方策 |
イクスポーティンでは、Exportin-5単体の結晶構造解析を完結させて、2者複合体、3者複合体の構造と合わせて、Exportin-5によるPre-miRNAの核外輸送機構の全容を解明する予定である。
組み替えボルトの結晶を用いて高分解能の構造解析を2.8オングストロームで行う。そのために、同型性のある結晶を再現性良く得る凍結方法を確立して、多数の結晶を用いて回折強度データを収集する。高分解能構造に基づいて未確定のキャップリング構造を確定する予定である。
ギャップ結合チャネルは、6年以上掛けて発現・精製・結晶化を確立した人から引き継いで、徐々にその人のレベルに近づいて閉孔型の3.5Å分解能の結晶構造解析を行う。半チャネルを形成するコネキシンの発現精製に成功した。この結晶構造解析を行い、チャネルとの構造の際を明らかにする。
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