Ｘ線結晶構造解析による細胞内及び細胞間での物質輸送の研究

2013 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 21227003
• 研究機関: 兵庫県立大学
• 研究代表者: 月原 冨武 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 特任教授 (00032277)
• 研究分担者: 山下 栄樹 大阪大学, たんぱく質研究所, 助教 (00294132) ; 田中 秀明 大阪大学, たんぱく質研究所, 助教 (40346169)
• 研究期間 (年度): 2009-05-11 – 2014-03-31
• キーワード: 超分子 / 蛋白質 / 立体構造 / X線結晶構造解析 / 膜タンパク質 / 輸送

研究概要

高等な生物では、特定の分子を働くべき場所に輸送する仕組みがあり、輸送に関わる生体超分子の立体構造を決定して、その働きの仕組みを明らかにするのが本研究の目的である。細胞間輸送ではギャップジャンクション、細胞質から細胞外排出及び核内への輸送ではボルト、核外への輸送ではイクスポーティンを研究対象に取りあげている。
小RNAの核外輸送に関わる、イクスポーティン-5の研究では、イクスポーティン-5・ランGTP・プレ-マイクロRNA３者複合体の、イクスポーティン-5・ランGTP２者複合体の結晶構造解析に加えて、イクスポーティン-5単体の結晶構造解析を行った。意外にも２者複合体は３者複合体と同じ構造であった。
細胞内での輸送に関わると考えられているボルトは分子量が10MDaを超える巨大な粒子である。ボルトの39量体構造を形成するのに重要と思われるC末端領域の構造が未知である。この領域の構造を新しい構造精密化法によって決定した。昆虫細胞の発現系でボルトの調製法を確立し、昆虫細胞発現系によってフレキシブルなMVPのN末端（粒子ウェストを形成）をロイシンジッパーで固定化した組み換えボルトを調製して、均一な電子顕微鏡像を与える試料の大量調製に成功した。異方性が有るが2.8Åの回折像を与える結晶を得た。
ギャップ結合チャネルの構造に基づいて、半チャネルが細胞間でドッキングしてチャネルを形成する機構を明らかにする研究を行った。Cx26の変異体，Cx32の野生型及び変異体を調製して、ホモロジーモデリングに基づいてチャネル形成に重要な水素結合を特定した。コネキシン26ギャップ結合チャネルは3.5Å分解能で構造決定されているが、細胞内ループやC末端ループの構造は未確定である。分子動力学計算を加味した構造解析法を考案して、この部分の構造を決定した。

現在までの達成度 (区分)

理由

25年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

25年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] Lipid-induced conformational changes within the cytochrome b6f complex of oxygenic photosynthesis. (2013)
  • 著者名/発表者名: Hasan S. S., Stofleth J. T., Yamashita E., Cramer W. A.
  • 雑誌名: Biochemistry. 巻: 52 ページ: 2649-2654
  • DOI: 10.1021/bi301638h.
  • 査読あり
• [雑誌論文] A new protein complex promoting the assembly of Rad51 filaments. (2013)
  • 著者名/発表者名: Sasanuma H., Tawaramoto M. S., Lao J. P., Hosaka H., Sanda E., Suzuki M., Yamashita E., Hunter N., Shinohara M., Nakagawa A., Shinohara A.
  • 雑誌名: Nat. Commun. 巻: 4 ページ: 1676, 1-13
  • DOI: 10.1038/ncomms2678.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of human importin β-Snail zinc finger domain complex. (2013)
  • 著者名/発表者名: Choi S., Song J., Son S.Y., Park I.Y., Yamashita E., Lee S.J..
  • 雑誌名: Acta Cryst. F 巻: 69 ページ: 1049-1051
  • DOI: 10.1042/BST20120211
  • 査読あり
• [雑誌論文] New features of vault architecture and dynamics revealed by novel refinement using the deformable elastic network approach. (2013)
  • 著者名/発表者名: Casanas A, Querol-Audí J, Guerra P, Pous J, Tanaka H, Tsukihara T, Verdaguer N, Fita I
  • 雑誌名: Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 巻: 69 ページ: 1054-1061
  • DOI: 10.1107/S0907444913004472.
  • 査読あり
• [雑誌論文] A mechanism of gap junction docking revealed by functional rescue of a human disease-linked connexin mutant. (2013)
  • 著者名/発表者名: Gong XQ, Nakagawa S, Tsukihara T, Bai D.
  • 雑誌名: J Cell Sci. 巻: 126 ページ: 3113-3120
  • DOI: 10.1242/jcs.123430.
  • 査読あり
• [学会発表] SPring-8生体超分子複合体構造解析ビームライン（大阪大学蛋白質研究所）BL44XUの現状 (2014)
  • 著者名/発表者名: 山下栄樹
  • 学会等名: 第27回日本放射光学会年会放射光科学合同シンポジウム
  • 発表場所: 広島国際会議場（広島県広島市）
  • 年月日: 20140111-20140113
• [学会発表] Novel computational scheme for structural determination of multiple conformational segments of biological macromolecules employing crystallographic electron density data in low resolution regions (2014)
  • 著者名/発表者名: Kiyohito Kihira, Jiyoung Kang, Hiroshi Nishigami, Masaru Tateno, Tomitake Tsukihara
  • 学会等名: 1st International Picobiology Institute Symposium
  • 発表場所: SPring-8(兵庫県佐用郡佐用町）
  • 年月日: 20140107-20140108
• [学会発表] Novel structural determination scheme of multiple conformational segments of biological macromolecules employing crystallographic electron density data in low-angle/low-resolution regions, (2013)
  • 著者名/発表者名: Kiyohito Kihira, Jiyoung Kang, Hiroshi Nishigami, Masaru Tateno, Tomitake Tukihara
  • 学会等名: 第36回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: 神戸ポートアイランド（兵庫県神戸市）
  • 年月日: 20131203-20131206
• [学会発表] Novel structural determination algorithm of multiple conformational segments of biological macromolecules employing crystallographic electron density data in low-angle/low-resolution regions (2013)
  • 著者名/発表者名: Jiyoung Kang, Kiyohito Kihira, Hiroshi Nishigami, Masaru Tateno and Tomitake Tsukihara
  • 学会等名: 日本バイオインフォマティクス学会2013年年会&第2回生命医薬情報学連合大会
  • 発表場所: タワーホール船堀（東京都江戸川区）
  • 年月日: 20131029-20131031
• [学会発表] リガンドフリー型Exportin-5 の構造解析 (2013)
  • 著者名/発表者名: 山澤龍治・小林 武・慈幸千真理・李 守宰・中川敦史・柴田理志・岡 正啓・片平じゅん・ 米田悦啓・月原冨武・山下栄樹
  • 学会等名: 平成25年度日本結晶学会年会及び総会
  • 発表場所: 熊本大学 黒髪南地区（熊本県熊本市）
  • 年月日: 20131012-20131013
• [学会発表] A novel algorithm for structural determination of multiple conformational segments in biological macromolecules employing electron density data involved in small scattering-angle regions (2013)
  • 著者名/発表者名: Kiyohito Kihira, Jiyoung Kang, Hiroshi Nishigami, Masaru Tateno, Tomitake Tsukihara
  • 学会等名: 第86回日本生化学会大会
  • 発表場所: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • 年月日: 20130911-20130913
• [学会発表] A gap junction docking mechanism revealed by functional rescue of a human disease-linked connexin mutant. (2013)
  • 著者名/発表者名: Gong, X.Q., Nakagawa, S., Tsukihara, T. and Bai, D.
  • 学会等名: International Gap Junction Conference
  • 発表場所: Francis Marion Hotel, Charleston, South Carolina, USA
  • 年月日: 20130713-20130718
• [学会発表] 複雑さと精緻さを追求する構造生命科学/Structural life science (2013)
  • 著者名/発表者名: 月原冨武
  • 学会等名: 第13回日本蛋白質科学会年会
  • 発表場所: とりぎん文化会館（鳥取県鳥取市）
  • 年月日: 20130612-20130614
  • 招待講演
• [学会発表] ロイシンジッパー付加によるボルト粒子の安定化と発現量の向上 (2013)
  • 著者名/発表者名: 田中秀明、藤田千鶴子、岩崎憲治、月原冨武
  • 学会等名: 第13回日本蛋白質科学会年会
  • 発表場所: とりぎん文化会館（鳥取県鳥取市）
  • 年月日: 20130612-20130614
• [備考] 兵庫県立大学生命理学研究科 月原研究室ホームページ
  • URL: http://www.sci.u-hyogo.ac.jp/life/GCOE/japanese/pico_intro/tsukihara/index.html