| 研究概要 |
平成24年度は、Sox9-EGFPマウス由来初代軟骨細胞を用いてSox9発現誘導活性を有する化合物のスクリーニングを引き続き実施した。生後１～２日目のSox9-EGFPマウスの肋骨を採取し、トリプシンおよびコラゲナーゼ処理にて軟骨細胞初代培養系を作製した。96穴プレートに１穴あたり10000個の細胞を播種し２日間培養後、購入および入手したしたChemical libraryの化合物を添加した。24時間後蛍光マイクロプレートリーダーにてEGFPの蛍光強度を測定し、コントロールの３倍以上の蛍光強度を誘導する化合物のリストを作成した。この方法にて現在まで約10000種類以上の化合物スクリーニングを実施し終了した。この結果、17種類の低分子化合物が得られた。２次スクリーニングとして、EGFP誘導活性を有する化合物をマウス初代軟骨培養細胞に添加後、４８時間でのCol2a1およびアグリカン遺伝子発現上昇をリアルタイムPCRで解析し、最終的に7種類の化合物が獲得された。これら7種類の化合物は、Sox9-EGFPマウスの膝関節を摘出し実体顕微鏡下に関節内投与しEGFP蛍光強度を蛍光実体顕微鏡で観察したところ、組織においてもEGFP発現誘導活性を有していることを確認した。よってこの7種類の低分子合成化合物は、関節軟骨においてSox9, Col2a1およびアグリカン遺伝子発現を誘導し、関節症治療薬のシード化合物で有ると期待できた。次に3.5kg日本白色家兎部分半月板切除による変形性関節症モデルを作成し、上述の低分子化合物を連日関節内に4週間注射投与した。現在、関節軟骨修復効果をマイクロCTおよび組織学的解析にて検討を行い、至適投与濃度および投与量を検討中である。
|
