| 研究課題/領域番号 |
21310022
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
汪 達紘 岡山大学, 大学院・医歯薬総合研究科, 助教 (90294404)
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| 研究分担者 |
筒井 研 岡山大学, 自然生命科学研究支援センター, 教授 (70108158)
佐野 訓明 岡山大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 助教 (00294405)
中村 和行 山口大学, 医学(系)研究科, 教授 (90107748)
藤田 洋史 岡山大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 助教 (20423288)
荻野 景規 岡山大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 教授 (70204104)
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| キーワード | 環境影響評価 / 生体影響評価 / カタラーゼ / 初代培養肝細胞 / 酸化ストレス / 過酸化水素 / ヒドロキノン / ローソン |
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| 研究概要 |
この研究ではカタラーゼ遺伝子変異マウスの初代培養肝細胞を用いた酸化ストレス誘発有害物質のスクリーニングを簡便に行う手法の開発とその実用化を目指している。今年度は以下の成績を得た。
1. カタラーゼ遺伝子正常及び変異マウスを用い肝臓組織の分離・灌流について様々な条件下で繰り返しを検討し、現在、トリパンブルー排除試験で85%以上の生存率を示す肝細胞集団を得ることができ、マウスを用いた肝臓組織の分離・灌流法を確立した。得られた細胞を無血清培地で培養し、培養24時間後に、肝細胞は島状の単層が形成され、実験に供することとした。
2. 得られた細胞を同定するため、ゲノムDNAを抽出し、PCRを用いて制限酵素処理の処理によって、カタラーゼ遺伝子正常及び変異マウスの肝細胞であることを確認した。
3. 薬物代謝酵素誘導剤を用いて、両種マウスの肝細胞におけるCYP 2E1が誘導されることがわかった。
4. Lawsone、hydroquinone等の化学物質を両種マウスの肝細胞に曝露させると濃度依存的に細胞障害が引き起こされ、しかもカタラーゼ活性の低いアカタラセミアマウスの肝細胞の方がこられの化学物質に対する感受性が高く、カタラーゼ活性とは関連があることが明らかとなった。また、その結果を、これまでに得られているカタラーゼ変異遺伝子導入大腸菌を用いた曝露結果と照らし合せ、両者の一致性も明らかとなった。
5. 蛍光色素Hoechst 33342を用いてヘンナ系染毛剤の主要成分であるLawsoneの曝露で両種マウスの肝細胞アポトーシスを検出した。特に200μMのLawsoneでは細胞に48時間を曝露すると、カタラーゼ活性の低いアカタラセミアマウスの肝細胞の方がクロマチン凝集の割合が高く、細胞核の断片化が顕著であった。
本研究によって得られた両種マウスの初代培養肝細胞を、化学物質に曝露させることより生ずる生存率の差異或いはアポトーシスの有無から、毒性発現が酸化的ストレスによるか否かを評価することに役立つと思われる。
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