| 研究概要 |
DNA-タンパク質クロスリンク(DPC)は,放射線や変異原物質により誘発されるゲノム損傷であり,複製や転写を強く阻害するため細胞に重篤な影響を与えると考えられる。これまでの研究で,原核生物では,DPCに対しヌクレオチド除去修復(NER)と相同組換え(HR)が協調的に働くが,哺乳類細胞のNERは除去できるタンパクの上限サイズが小さいためDPC修復には関わらず,DPCはHRで回避されることが示唆された。本研究では,これらの研究を発展的に展開し,ゲノムにおけるDPCの修復動態とDNA損傷応答について検討した。
ゲノムにおけるDPCの修復動態を調べるために,高感度なDPC定量法を検討した。細胞をアルデヒド化合物で処理し,ゲノムDNAを塩化セシウム密度勾配遠心法により高純度に精製した。このDNAをFITCとインキュベートし,DNAにクロスリンクしたタンパク質をFITC標識した。FITCの定量は,直接蛍光測定および抗FITC抗体を用いたWestern法を用いた。いずれの場合も,クロスリンクタンパク質によるシグナルが観察されたが,後者の方が高感度に損傷を検出できることが明らかとなった。今後,Western法を用いゲノムにおけるDPCの修復動態を調べる予定である。DNA損傷応答を調べるため,細胞をDPC誘発剤で処理し,ATRおよびATM経路の下流にあるCHK1およびCHK2のリン酸化状態の経時変化を調べた。その結果,ATR経路がまず活性化され,時間的に遅れてATM経路が活性化されることが明らかとなった。この結果から,DPCにより複製フォークの進行が止まると,ATR経路が活性化され,その後何らかの形でATM経路の活性化につながる可能性が示唆された。
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