| 研究課題/領域番号 |
21310133
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
坂口 和靖 北海道大学, 大学院・理学研究院, 教授 (00315053)
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| 研究分担者 |
今川 敏明 北海道大学, 大学院・理学研究院, 准教授 (20142177)
中馬 吉郎 北海道大学, 大学院・理学研究院, 助教 (40372263)
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| キーワード | 蛋白質 / 癌 / シグナル伝達 / 進化 / 生体分子 / 生体分子 |
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| 研究概要 |
p53の四量体形成はその機能発現に必須である。ヒト悪性腫瘍において、p53四量体形成ドメイン31アミノ酸残基中、24残基に49個のミスセンス変異が報告されている。これらの変異によるp53機能の不活性化機構の解明は、p53遺伝子のミスセンス変異による細胞癌化を理解する上できわめて重要である。一方、p53タンパク質は、魚類から哺乳類に至るまで広く脊椎動物において存在している。本研究では、『癌抑制タンパク質p53の四量体形成ドメイン変異および進化的置換による四量体形成とそれに引き続く生物イベントを定量的に解析し、p53四量体安定性と機能不全との間の閾値問題を解明する』ことを目的としている。
本年度は、魚類から哺乳類に至る様々な種のp53四量体形成ドメインペプチドについて網羅的に解析するため、未知であった爬虫類のものとしてSoftshell Turtle由来のp53を新規にクローニングした。化学合成した各ペプチドの多量体形成能をゲル濾過クロマトグラフィーおよび円二色性(CD)により解析した。その結果、進化と四量体形成能の間に顕著な相関があることを見出した。さらに、細胞内でのp53機能に対する閾値の解析のため、生理学的濃度において、四量体形成能を解析可能なbimolecular fluorescent complementation法を用いる解析系の構築を実施した。このために、蛍光タンパク質VenusのN末端側あるいはC末端側フラグメントと、野生型p53および四量体構造の安定性が異なる2種の変異体との融合タンパク質に対する発現ベクターを作製した。また、生理学的濃度において転写活性を測定可能な蛍光タンパク質リポータアッセイ法を用いた感度の高い解析系の構築を検討した。
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