| 研究課題/領域番号 |
21310138
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| 研究機関 | 富山大学 |
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研究代表者 |
友廣 岳則 富山大学, 大学院・医学薬学研究部(薬学), 准教授 (70357581)
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| 研究分担者 |
畑中 保丸 富山大学, 大学院・医学薬学研究部(薬学), 教授 (30111181)
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| キーワード | 光クロスリンク / ジアジリン / 蛍光ラベル / 生体分子相互作用解析 / 光シス-トランス異性化 |
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| 研究概要 |
本課題は、タンパク質機能部位に直接蛍光ラベルを光照射のみで構築する技術の開発であり、相互作用タンパク質の蛍光イメージングや基質結合解析への応用を目的とする。光アフィニティーラベル法を利用して、まず結合タンパク質を光捕捉し、さらに二段階目の光照射により、クロスリンクした基質分子を解離させつつ相互作用部位を蛍光化する。初年度は光反応性ユニットであるジヒドロキシ桂皮酸型ジアジリン誘導体を作成し、それを導入して光反応性のATP、DNA、タンパク質プローブを作成した。本年度は各プローブの光化学特性評価を行いながら、それぞれの結合タンパク質への蛍光移植システムの検証を行った。1)安定性を向上させたリン酸アミド型ATPプローブを作成した。光照射によるクマリン形成を確認した後、ATP結合タンパク質であるグルタミン酸デヒドロゲナーゼ(GDH)の蛍光化に応用した。光クロスリンクとクマリン形成を照射波長と反応温度により制御することでGDHの特異的蛍光ラベル化を達成した。2)光反応性白金錯体を導入したDNAプローブを数種作成し、NA損傷部位に親和性の高いHMGB(高速移動群)タンパク質を蛍光ラベルした。3)初年度に光反応性リゾチームによるリゾチーム抗体軽鎖へのラベルを確認したので、次にB細胞を用いて細胞膜表面に発現したリゾチーム抗体へのラベル化を評価した。光クロスリンクを0℃で行った後では細胞は無蛍光性であったが、照射波長を変更し37℃にしたところ、B細胞のみからクマリン由来の蛍光の増加が確認された。以上の結果から、細胞膜タンパク質の特異的蛍光ラベルを、細胞レベルで達成できた。
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