| 研究概要 |
ウシ心筋と細菌のチトクロムc酸化酵素のプロトン(H^+)輸送経路としてそれぞれ3つの経路(D-, K-, H-pathway)が提案されている。D-pathwayは水形成用とポンプ用のH^+を輸送すると提唱され、細菌酵素の変異体解析が支持している。この経路は、細菌とウシの間で酷似し、しかも機能に必須のアミノ酸残基が保存されている。したがって、ウシ酵素のD-pathwayも同じ機能をもつと推測され、我々のウシ酵素H-pathway H^+ポンプ説と対立している。昨年度、細菌によるD-pathway H^+ポンプに必須のアミノ酸残基に対応したウシ酵素部位を変異体(Asn98Asp, Asn163Asp)解析した。いずれの変異も機能に影響を与えず、D-pathway H^+ポンプ説を支持しない。ウシ酵素は、ミトコンドリア由来の3つのサブユニット(SI-III)と核由来の10個のサブユニットにより構成される。我々はHeLa細胞を宿主とするウシ(SI)/ヒト雑種酵素発現系を開発し、変異体を作製している。上述した細菌酵素の結果との不一致に対して、変異雑種酵素が宿主内で新たな変異を起こし野生型に戻った可能性を考えた。そこで各サブユニット遺伝子の塩基配列を本年度決定した。一方、細菌D-pathwayの水形成用H^+輸送機能に必須のアミノ酸残基に対応したウシ酵素部位を変異(Glu242GlnとAsp91Asn)させ解析している。予備的な結果ではあるが、水形成用H^+輸送機能を支持する。大腸菌無細胞系で、細菌酵素のSI-IIIを合成し、野生型と遜色がない標品を得た。低い機能発現効率の向上を図るために、本来の宿主であるParacoccus denitrificansの無細胞系の構築を始めた。本年度、各サブユニット発現ベクター、GFPのコントロールベクターを構築し、またtRNAs調製法を確立した。
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