|
本研究では、PCNA結合因子の中でCdt1がどのようにして、1)ユビキチンリガーゼCRL4-Cdt2に特異的に認識されてユビキチン化を受け分解されるのか、2)その機能がどのように制御されているのか、また、3)S期のみならずUV照射などのDNA損傷を受けた場合にも、どのような機構でCdt1が分解されるのか研究を行い、それぞれ次のような結果を得た。
1. CRL4-Cdt2により分解されるCdt1と分解されないDNAリガーゼIとのアミノ酸配列の比較とキメラ体の作成によりPIPボックス内のTD配列とPIPボックス下流のK/R-K/R配列が重要であること、その隣の酸性アミノ酸が分解に抑制的に働くことを見いだしたので、これらをDNAリガーゼに導入することにより、その分解が誘導されることを明らかにした。CRL4-Cdt2のターゲットは、厳密に選別されることによりPCNA依存の染色体維持機構が働くと言える。
2. Cdt1の分解が起こるS期やUV照射時にCdt2はリン酸化される。UV照射後にはチェックポイントキナーゼATRが活性化されるので、CRL4-Cdt2によるCdt1分解に付いて検討し、ATR阻害剤カフェイン、ATRのノックダウンによりCdt1の分解が抑制されることを見いだした。さらに、Cdt2がATRによりリン酸化される予備的結果を得た。
3. マイクロポアーを用いて細胞核に局所的にUVを照射しCdt1の分解の様子を調べた。Cdt1もCdt2もPCNA依存的にDNA損傷部位に素早く集積することを明らかにした。その集積は、ヌクレオチド除去修復欠損XPA細胞で遅れること、またPCNAのローダータンパク質p140-RFCを阻害するとCdt1の分解が抑制されることを明らかにした。これらの結果をもとに損傷修復過程でのCdt1の分解の意義を検討したい。
|
