| 研究課題/領域番号 |
21380057
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
西山 真 東京大学, 生物生産工学研究センター, 教授 (00208240)
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| 研究分担者 |
富田 武郎 東京大学, 生物生産工学研究センター, 助教 (50447364)
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| キーワード | リジン生合成 / アスパラギン酸キナーゼ / フィードバック阻害 / X線結晶構造解析 / キャリアタンパク質 |
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| 研究概要 |
a)CgAKをThrだけ含む活性化状態、ThrとLysを結合した不活性化状態で結晶化に成功し、X練結晶構造解析により立体構造を決定した。また、CgAKのSer301Phe(βサブユニットではSer52Phe)変異体はLysアナログであるAECに耐性を示し、Lys、Thrの両方のエフェクターを結合しても阻害を示さない。そこで、同変異体についても結晶構造の決定を行った。その結果、触媒サブユニットドメインの開閉、及び2つのサブユニットの相互作用の違いに基づく微細な活性中心付近の動きが明らかとなり、フィードバック阻害の全体像が明らかになった
b)Thr感受性TtAKの制御ドメインの構造決定に成功し、CgAKと構造比較を行った。
c)HCSおよびフィードバック阻害耐性変異型酵素を精製し、結晶化条件のスクリーニングを行い、2-オキソグルタル酸、ホモクエン酸、リジンを含む各複合体の結晶構造を決定し、触媒機構、阻害機構を明らかにした。
d)LysKは、生合成系の最終段階に関わり、AAAからキャリアタンパク質LysWを外してLysを切り出す酵素である。In vitro再構成系からLysKを除くと、LysWの分子量がLysの分子量分大きいものが得られ、MALDI-TOF-MS、およびMS/MSを用いてAAAのアミノ基とLysWのC末端のカルボキシル基がペプチド結合によりつながっていることが明らかとなっている。しかし、Gluは側鎖にもγカルボキシル基を持つため、α、γのどちらのカルボキシル基に結合しているかが不明であった。LysWのC末端領域のアミノ酸配列に加えて、C末端のGluのα、γのカルボキシル基にLysを結合した合成ペプチドを調製し、それを基質としてLysKの反応を行った結果、LysKがC末端のGluのγカルボキシル基に結合したLysを特異的に切り離す活性を持つことを明らかにした。
e)LysWのC末端のGluのγカルボキシル基にAAA結合したLysW-γ-AAA単体、およびそれとLysZ複合体の結晶化に成功した。現在データから構造の精密化を行っている。
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