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2010 年度 実績報告書

超好熱菌由来サチライシンの成熟化機構の解明と利用法の開発

研究課題

研究課題/領域番号 21380065
研究機関大阪大学

研究代表者

金谷 茂則  大阪大学, 工学研究科, 教授 (30273585)

キーワードサチライシン / セリンプロテアーゼ / 超好熱菌 / 成熟化 / プロペプチド / プリオン / タンパク工学
研究概要

(1) Tk-SPの構造形成機構と成熟化機構の解析:Tk-SPの成熟化機構を明らかにするために、活性が大きく低下した活性中心変異体Tk-S359Cやその前駆体(Pro-Tk-S359C、ProC-Tk-S359C)、さらには成熟体から切り離されたプロペプチド(ProNとProC)を構築し、それらの諸特性を解析した。その結果、ProNは細菌由来サチライシンやTk-サチライシンのプロペプチド同様成熟体の阻害剤として働くこと、最初にPrON切断され、ProC-Tk-S359Cと不活性な複合体を形成すること、Tk-SPではなく、Tk-SPにProCのつながったProC-Tk-SPが本来の成熟体であることを明らかにした。
(2) Tk-サチライシンのタンパク工学的機能改変:ランダム変異とカゼインプレートアッセイ法によるスクリーニングを組み合わせた進化工学的手法を用いることにより、成熟化速度の向上した変異体E61KおよびL69Pを取得することに成功した。いずれもプロペプチド領域に変異を有していた。また、基質結合部位の入口をひろげるような変異を導入することにより、タンパク質基質(アゾカゼイン)に対する活性が約2倍に向上した変異体P238Gを取得することに成功した。
(3)プロテアーゼの新たな利用法の開発:Tk-サチライシンが、プリオン病に感染したマウスの脳ホモジネート中の異常プリオンを分解することを明らかにした。また、分解条件を検討することにより、Tk-サチライシンは、3%SDS存在下、100℃の条件であれば5分程度の短時間で異常プリオンを分解できることを確認した。さらに、Tk-サチライシンは既存のプリオン分解酵素であるPrionzymeより非常に高いプリオン分解活性を有することを明らかにした。

  • 研究成果

    (10件)

すべて 2011 2010

すべて 雑誌論文 (3件) (うち査読あり 3件) 学会発表 (7件)

  • [雑誌論文] Inhibition of chymotrypsin-and subtilisin-like serine proteases with Tk-serpin from hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakaraensis.2011

    • 著者名/発表者名
      Tanaka, S., Koga, Y., Takano, K., Kanaya, S.
    • 雑誌名

      Biochim.Biophys.Acta

      巻: 1814 ページ: 299-307

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Subtilisin-like serine protease from hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakaraensis with N-and C-terminal propeptides2010

    • 著者名/発表者名
      Foophow, T., Tanaka, S., Koga, Y., Takano, K., Kanava, S.
    • 雑誌名

      Protein Eng.Des.Sel.

      巻: 23 ページ: 347-355

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Crystal structure of a subtilisin homologue, Tk-SP from Ther mococcus kodakaraensis : requirement of a C-terminal β-jelly roll domain for hyperstability.2010

    • 著者名/発表者名
      Foophow, T., Tanaka, S., An gkawidjaja, C., Koga, Y., Takano, K., Kanaya, S.
    • 雑誌名

      J.Mol.Biol.

      巻: 400 ページ: 865-877

    • 査読あり
  • [学会発表] Studies on the maturation process of subtilisin-like serine protease, Tk-SP, from hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakaraensis2010

    • 著者名/発表者名
      Nitat Sinsereekul, Tita Foophow, Yuichi Koga, Kazufumi Takano, Shigenori Kanaya
    • 学会等名
      日本分子生物学会・生化学会合同年会
    • 発表場所
      神戸国際会議場、神戸市
    • 年月日
      20101207-20101210
  • [学会発表] 超好熱古細菌由来セリンプロテアーゼTk-SP65の特性解析2010

    • 著者名/発表者名
      平田あずみ、中堀美賀子、田中俊一、古賀雄一、高穿和文、金谷茂則
    • 学会等名
      日本分子生物学会・生化学会合同年会
    • 発表場所
      神戸国際会議場、神戸市
    • 年月日
      20101207-20101210
  • [学会発表] 超好熱始原菌由来サチライシンの成熟化における挿入配列の役割2010

    • 著者名/発表者名
      上原了, 田中俊一, 古賀雄一, 高野和文, 金谷茂則
    • 学会等名
      日本分子生物学会・生化学会合同年会
    • 発表場所
      神戸国際会議場、神戸市
    • 年月日
      20101207-20101210
  • [学会発表] 超好熱菌由来プロテアーゼによる異常プリオン蛋白質分解2010

    • 著者名/発表者名
      古賀雄一, 田中俊一, 作道章一, 高野和文, 金谷茂則
    • 学会等名
      日本生物工学会
    • 発表場所
      フェニックス・シーガイア・リゾート、宮崎
    • 年月日
      20101027-20101029
  • [学会発表] Tk-subtilisinの成熟化における安定化機構2010

    • 著者名/発表者名
      上原了, 田中俊一, 古賀雄一, 高野和文, 金谷茂則
    • 学会等名
      日本生物工学会
    • 発表場所
      フェニックス・シーガイア・リゾート、宮崎
    • 年月日
      20101027-20101029
  • [学会発表] Degradation of abnormal prion protein by a new protease from a hyperthermophile2010

    • 著者名/発表者名
      Yuichi Koga, Shun-ichi Tanaka, Akikazu Sakudo, Kazuyoshi Ikuta, Kazufumi Takano, Shigenori Kanaya
    • 学会等名
      PRION 2010
    • 発表場所
      Salzburg, Austria
    • 年月日
      20100908-20100911
  • [学会発表] 超好熱始原菌由来サチライシンの成熟化における挿入配列の役割2010

    • 著者名/発表者名
      上原了, 田中俊一, 古賀雄一, 高野和文, 金谷茂則
    • 学会等名
      第5回産業用酵素シンポジウム
    • 発表場所
      長浜
    • 年月日
      2010-11-06

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公開日: 2012-07-19  

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