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リソソーム酵素とその基質類似体との分子間相互作用を解明すると共に、リソソーム病関連変異酵素と結合し、これを安定化する化合物を見つけて酵素増強治療薬を開発する目的で研究を行った。
前年度に、野生型a-ガラクトシダーゼ(GLA)と1-デオキシガラクトノジリマイシン(DGJ)およびガラクトスタチン-バイサルファイト(GBS)との結合に関する熱力学的パラメータを決定した。今年度は、ファブリー病の病因遺伝子変異に基づくM51Iアミノ酸置換を持つ変異GLA(M51I-GLA)とDGJおよびGBSとの分子間相互作用を明らかにすべく、研究を進展させた。
まず、酵母の発現系でM51I-GLAを大量生産し、酵母の培養液から本酵素をカラムクロマトグラフィーで精製した。この変異酵素は、野生型酵素に比べて、中性および酸性環境下で不安定であったが、DGJおよびGBSの添加により、安定化した。この変異酵素の特異活性やミカエリス定数は、野生型GLAのそれらと変わりはなかったが、in silicoでの構造解析により、触媒部位から離れた分子表面に小さな構造変化が起こっていると考えられた。そのため、この変異酵素は、活性低下は見られないが、コンフォーメーションの異常により不安定化し、細胞内で過剰分解されて病気が惹起されると考えられた。DGJやGBSは、変異酵素の活性ポケットに入り、安定化すると思われた。M51I-GLAとDGJおよびGBSとの分子間相互作用を調べるため、表面プラズモン共鳴法を用いて、中性および酸性条件下での平衡定数、結合速度定数および解離速度定数を測定した。予想に反して、中性および酸性で解離速度定数に大きな違いはみられなかった。今後、リソソーム病治療薬開発のためには、リソソーム内(酸性)で変異酵素と解離し易い化合物の合成が必要になると考えられた。
基質類似体ライブラリーを用いて、GLAと結合する化合物の予備的探素を行った。
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