| 研究課題/領域番号 |
21390416
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
緒方 直史 東京大学, 医学部附属病院, 講師 (10361495)
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| 研究分担者 |
矢野 文子 東京大学, 医学部附属病院, 特任助教 (80529040)
三浦 俊樹 東京大学, 医学部附属病院, 特任講師 (20376479)
筑田 博隆 東京大学, 医学部附属病院, 助教 (30345219)
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| キーワード | 細胞・組織 / 骨軟骨代謝 / 副甲状腺ホルモン / 骨粗鬆症 |
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| 研究概要 |
酵母wo-hybrid assayを用いてPPRのC末側細胞内ドメインに結合する蛋白質を網羅的に探索したところ、新たな結合蛋白としてβカテニンを同定した。HEK293細胞および軟骨様細胞株であるATDC細胞にGFP標識したPTH受容体を強制発現させると、PTH受容体と内在性βカテニンが細胞内での共局在し、直接結合することを確認した(免疫沈降、Westernblot)。このPTH受容体とβカテニンとの結合はPTH刺激によって減弱し、軟骨細胞でも同様の傾向があることを確認した。Pm受容体の段階的deletion、mutagenesisによって、C末側582-585の4アミノ酸がβカテニンの結合に必須であることが示された。また、βカテニンと複合体を形成する接着蛋白であるカドヘリンもPTH受容体の同部位に結合し、PTH刺激によりその結合が減弱した。PTH刺激後の細胞内Ca2+濃度は、βカテニンsiRNAおよびPTH受容体(Δ582-585)変異体の強制発現によって消失した。マウス成長板の免疫染色によって、PTH受容体とβカテニンは前肥大軟骨細胞層に共局在していた。マウス軟骨前駆細胞ATDC5倍養系にPTH(1-34)を投与すると、軟骨肥大分化マーカーであるCOL10の転写活性(luciferase assay)も発現レベル(retal-time RT-PCR)も抑制されたが、これらはいずれも恒常活性型βカテニンの過剰発現で回復した。この回復効果はPTH受容体(Δ582-585)変異体導入ATDC細胞においては見られなかった。また結合部位を欠損しているPTH受容体遺伝子をマウスの軟骨細胞に強制発現させるための遺伝子操作マウスの作成準備を開始し、コンストラクトが作成された。
以上より軟骨細胞におけるPTH/PTHrPシグナルとして、βカテニンがPTH受容体細胞内ドメインに直接結合し、その下流のGαs/cAMP)を抑制しGαq/Ca2+を促進して、肥大分化を調節している可能性が確認された。
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