| 研究概要 |
本年度は以下の要領で研究をおこなった。
1.in vitroの解析
i)p62欠損(p62(-/-))MEF細胞のアポトーシス抵抗性とSTAT3のリン酸化の亢進が判明したため、これに続くアポトーシスシグナルの検索をおこなった。細胞傷害刺激(UVB照射)後のBcl-2,Bcl-xL,Baxの変化についてp62(-/-)および野生型のMEF細胞を用いてウェスタンブロットで調べたところ、p62(-/-)MEF細胞ではBcl-2の発現レベルの上昇、Baxの発現の低下を認めたが、Bcl-xLの発現は有意な差はみられなかった。一方、mRNAレベルではBcl-2,Bcl-xLレベルはともに有意に上昇していた。
ii)p62の結合物質の検索p62の結合物質を同定するためLC/MS/MSを用いて検索した。FLAG-p62発現ベクター、および、コントロールとしてFALGのみをp62(-/-)MEF細胞にトランスフェクションし細胞中で強制発現させ、FLAG抗体によって、免疫沈降法により結合物質を共沈させた。これらをSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離ののち銀染色し、FLAG-p62発現細胞とコントロールに差のあったバンドを切り出し、プロテアーゼで分解しサンプルとした。ペプチド断片をLC/MS/MSにより測定し、PMF法による解析の結果、ペプチドのピークから、p62に結合する物質として、新規にMitofilinが同定された。
II.in vivoの解析
マウス生体における細胞傷害刺激(UVB照射)によるアポトーシスを確認したところ、p62(-/-)マウスでは野生型に対して有意にアポトーシスが起きにくくなっていることを確認した。
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