| 研究概要 |
本年度は以下の要領で研究をおこなった。
I.in vitroの解析
i)p62欠損(p62(-/-))MEF細胞のアポトーシス抵抗性についてBc1-2,Bc1-xL,Baxの変化についての前年度の検討に加え、mRNAレベルでのBc1-2,Bc1-xLレベルもReal time PCRで検討し、ともに有意に上昇していることを確認した。また、活性酸素の産生をp62(-/-)MEF細胞と野生型の細胞についてDCFH-DAで染色し蛍光強度を調べたところ、照射前後とも有意にp62(-/-)MEF細胞の方が少なかった。ATMの発現をmRNAレベルで調べたところ有意差はなかった。一方PDGFからのシグナルをみるためSrcのリン酸化活性を調べたところ、Srcのリン酸化活性は上昇していた。
ii)p62の結合物質の検索FLAG-p62発現ベクター、および、コントロールとしてFALGのみをp62(-/-)MEF細胞にトランスフェクションし細胞中で強制発現させ、FLAG抗体によって、免疫沈降法により結合物質を共沈させ、SDS-PAGEによって分離し、ペプチド断片をLC/MS/MSによる解析の結果からp62に結合する物質としてMitofilinが同定されたが、追加で検証実験をおこないFLAGのみのコントロールによる免疫沈降を行ったところ、同様な物質が同定されバックグラウンドである可能性が示唆された。
II.in vivoの解析
マウス生体における細胞傷害刺激(UVB照射)によるアポトーシスを確認したところ、p62(-/-)マウスでは野生型に対して有意にアポトーシスが起きにくくなっていることを確認した。
III.その他p62(-/-)マウスの飼育の過程で副産物としてNrf(-/-)マウスとの交配によりNASHを起こすことを偶然発見し特許を申請した。
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