| 研究概要 |
動物タンパク質に結合している糖鎖の多くは生理活性発現に重要な働きをしていることから,糖鎖構造と活性発現の相関を明らかにすることが重要であり,それには糖鎖ライブラリーの活用が有効である。本研究では,種々の糖転移酵素遺伝子を導入した複数のバキュロウイルスを時間差で多重感染させる培養戦略によって,糖転移酵素の種類と濃度を時系列的に変化させる糖鎖修飾システムを昆虫細胞培養系内に形成させ,様々に糖鎖修飾したタンパク質の生産を可能にする組換えタンパク質糖鎖修飾ライブラリー構築システムを開発することを目的とする。
昨年の糖転移酵素β-1,4-Galactosyltransferase発現バキュロウイルス(AcGal-T)に加え,N-Acetylglucosaminyl transferase II発現バキュロウイルス(AcGlcNac-T)を新たに作成した。一方,糖鎖修飾するモデルタンパク質として0型糖鎖を有するHuman interleukine-2(hIL-2)のcDNAをGP64プロモーター(P_<gp64>)下流に導入した組換えバキュロウイルス(AchIL-2)を構築し,Sf9昆虫細胞のAchIL-2単独感染によるhIL-2の生成挙動をウェスタンブロッティングにより分析した。その結果,生成したhIL-2は感染中期に急激に加水分解された。そこで,この加水分解の抑制方法を検討したところ,培地への10%ペプトンまたはプロテアーゼ阻害剤カクテルの添加の有効性が示された。また,プロテアーゼ阻害剤の組み合わせ効果から,hIL-2分解はシステインプロテアーゼに起因することが示唆された。さらに,hIL-2の一次構造に対するプロテアーゼ切断部位のスクリーニングから,質量分析のための糖鎖の切り出しにはプロティナーゼK処理が有効であることが示された。
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