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本年度はpolymeraseの校正モードの活性を担うexonuclease活性部位に変異を入れたpolymeraseからDNA polymerase-PCNA-DNA複合体を再構成し、単粒子解析によって立体構造を得た。これまでSteitz等によってPCNA非存在下において変異型polymeraseとDNAの共結晶が得られており、DNAがexonuclease活性部位からpolymerase活性部位に転移した複製モードの構造が得られていた。しかしながら我々の変異型DNA polymerase-PCNA-DNA複合体の構造は野生型の複合体(校正モード)の構造と有意な差が確認できなかった。これは我々が昨年までに新規に明らかにしたpolymeraseとPCNA間の第2の結合に起因し、PCNAを含んだより生理的な構造においては、モード間の切換えはDNAとpolymeraseのみでは決まらず、PCNAが従来考えられていたよりも積極的に切換えの制御に関わっていることを示す。更にこれまでの解析が種に依存せず、一般性をもつことを、Thermococus kodakarensis (Tko)のDNA polymerase及びPCNAからなる3者複合体を用いて確認した。精製した複合体を電子顕微鏡観察した結果、Pyrococcus furiosusの複合体より不安定で、解離したサブユニットや複合体間の凝集が確認できたものの、Pyrococcus furiosusの複合体と類似した2次元平均像が得られた。この他、レプリソームの形成に必須なGINS複合体の構造を単粒子解析で調べた。古細菌のGINSは1種或は2種のサブユニットからなる4量体を形成する。Thermoplasma acidophilumのGINSの電子顕微鏡試料を作成し、そのホモテトラマーの平均像を単粒子解析によって明らかにした。
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