| 研究概要 |
1.腸内連鎖球菌(Enterococcus hirae)のV型ATPaseはNtpFIKECGABDの9つの種類にサブユニットから構成されており、真核細胞のV型ATPaseより簡単なサブユニット組成であることから、V型ATPaseのサブユニット集合の研究に有用である。E.hiraeからのNtpK-ringの単独精製に加えて、大腸菌cell-free合成系でのNtpA_3B_3DG複合体、NtpEF複合体の再構成、NtpCの単独精製、さらにイオン輸送路を形成すると考えられている膜タンパク質NtpIのS.cerevisiaeを用いた大量発現にも成功し、全ての精製サブユニットを用いたin vitroでのV_1V_0複合体の再構成の実験系を構築した。
2.NtpK-ringへのNa+の結合はN,N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCCD)により影響を受け、Na+の結合の親和性がDCCDの作用により低下する。DCCD結合性NtpK-ringのNa+結合型、非結合型リングのそれぞれ2.4/3.1Å.の結晶構造解析に成功した。全てのNtpKモノマーのGlu139残基がDCCDにより修飾され、Na+の結合親和性を低下していると考えられた。NtpKリングの全体構造はDCCD結合により大きな構造変化は見られず、V-ATPaseによるNa+輸送反応におけるNtpKリングイオン結合部位のダイナミックな構造変化はないことが示唆された。
3.V1触媒部分の単位であるNtpA_1-B_1複合体はAMPPNP存在下で安定であり、3.4Åの分解能で結晶化に成功した。
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