| 研究概要 |
ジアシルグリセロールキナーゼ(DGK)は、生理活性脂質であるジアシルグリセロールとホスファチジン酸の細胞内濃度を調節し、細胞の生理機能を制御していると考えられている。哺乳類のDGKは現在まで10種類のアイソザイムのcDNAがクローニングされ、これらのアイソザイムはそのドメイン構造の違いから5つのサブグループ(I～V型)に分類されている。2型サブグループにはδ、η、κアイソザイムが属しており、これらのアイソザイムはすべてのアイソザイムに共通の触媒ドメインと亜鉛フィンガーの他に、pleckstrin homologyドメイン、sterie α-motifドメインを持っている。そしてDGKδにはN末端の配列が異なる、DGKηにはC末端の配列が異なるスプライシングバリアントが存在する。申請者はこれらの2型DGKが種々のシグナルタンパク質と結合することが報告されているRACK1(receptor foractivated C kinase 1)と結合することを見出したことから、2型DGK-RACK1複合体にさらに他のシグナルタンパク質が含まれているか質量分析計を用いて検討した。HEK293細胞に3xFLAG-DGKδ1(あるいはδ2,η1,η2,κ)単独あるいは3xFLAG-DGKδ1(あるいはδ2,η1,η2,κ)とRACK1の両者を発現させ、抗FLAG抗体を用いて免疫沈降を行なった。さらに沈降物をSDS-PAGE、銀染色した後、ゲルを分割し、トリプシンによるゲル内消化を行なった。得られたペプチド断片をHPLCで分離した後、質量分析を行なった。検出されたペプチドからデータベース解析によりタンパク質の同定を行なった。これによりRACK1の共発現の有無により異なるタンパク質が同定された。
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