| 研究概要 |
ヒト由来スフィンゴシン-1-リン酸リアーゼ(SPL)をGST融合タンパク質として大腸菌内で大量発現させることに成功した.結晶化や詳細な酵素反応の解析をおこなうには,可溶性画分における酵素発現量が少ないため,発現宿主株や培養条件の検討を進めている.細菌由来SPLについては結晶化に成功し,再現性も良好である.X線回折データ収集するためには結晶の凍結に工夫が必要であることが判明したため,クライオプロテクタントの選択とクライオ条件検討を進めている.蛍光検出HPLCを用いた酵素活性測定法に関して,内部標準物質を変更し,また,静電的な相互作用によるサンプルの流路系への吸着を抑制するように移動相や配管を改良した.反応生成物であるホスホエタノールアミンとSPLとの反応(本来のSPL反応を途中まで遡る反応)を調べた結果,β-脱離反応によってホスホエタノールアミンからエナミンを生じ,これが非酵素的にアセトアルデヒドに変換されて反応系内に蓄積することを見出した.SPLとスフィンゴシン 1-リン酸との反応においては,長鎖アルデヒドとホスホエタノールアミンが順次酵素から解離する経路と,ホスホエタノールアミンに対してβ-脱離反応を触媒してエナミンとして酵素から解離する経路の二つが起こりうることが示唆された.セリンパルミトイル転移酵素(SPT)については疾患変異型酵素を大腸菌内で大量発現させて電気泳動上均一にまで精製した.変異型酵素の安定性が低いことが影響し,結晶化には未だ成功していない.反応機構解析のため,反応中間体を模すことの出来る基質誘導体を約10種類化学合成した.また,ラジオアイソトープを使わない簡便な酵素活性測定法作製を試みた.反応生成物のケト基をナNADH依存的に還元する酵素をカップリングした反応測定系を設計した.現在この測定系について,従来法で得た酵素活性値との整合性等を検証している.
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