| 研究概要 |
我々は、いままでに、MCMのヘリカーゼ活性は、鋳型DNA上のT-rich一本鎖DNAにより活性化されること、およびCdt1と結合して複合体を形成しより強いヘリカーゼ活性を示すこと、さらにCdt1はATP結合によりその活性が制御される可能性を見出した。本年度は、様々なヌクレオチドを用いてコンピテションアッセイを行った結果、Cdt1が特異的にATPを結合することを示した。我々は、Cdt1とRctB(コレラ菌染色体複製の開始タンパク質)、DnaA、DnaC(大腸菌の複製の開始タンパク質とヘリカーゼロードするタンパク質)の間で限られた相同配列に注目した。RctBは典型的なATP結合モチーフを存在しないがATPに結合し、また保存されたアルギニンをセリンに置換するとRctBのATPの結合能が失われた。Cdt1と対応するアルギニン223をシスチンまたはセリンに置換した変異体を作製し、その変異体がATP結合活性を失ったことが分かった。マウスCdt1のこのアルギニン223は、ヒュマン、マウス、カエルとショウジョウバエでよく保存されます。この保存されたアルギニンにシスチンを置換したショウジョウバエCdt1の変異体は不妊の表現型が示されていた。また、Cdt1アルギニン342,346の変異体もATP結合活性を失ったことが分かった。それらの結果から、Cdt1は機能的に大腸菌のDnaCと類似し、MCMヘリカーゼと複合体を形成して染色体上にロードし、ATP結合能を発揮してMCMヘリカーゼ活性を活性化するという可能性を示唆します。
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