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哺乳類の雄性生殖細胞は精子形成過程のはじめに、精原細胞を体細胞分裂により増殖させた後減数分裂を開始する。減数分裂を正常に進めるための因子は数多く報告されているが、体細胞分裂より減数分裂への移行のメカニズムや関与する因子については不明である。我々が確立した精細胞共培養系下では体細胞分裂より減数分裂へ移行することができるcompetent精原細胞を人為的に作成できる。本課題では、自立的に減数分裂移行可能なcompetent精原細胞と不可能なnon competent精原細胞を用いて細胞生物学的手法により減数分裂誘導因子と抑制因子の存在を明らかにし、またその因子の同定を行うことを目的とする。
本年度は、減数分裂誘導因子を解析する細胞融合を用いた実験系の確立を目指した。細胞融合に用いるドナー細胞は、day5のICR mouse精巣より単離したnon competent精原細胞を、レシピエント細胞は、non competent精原細胞から精細胞共培養システム下で作製したcompetent精原細胞を、またday12のICR mouse精巣より単離した精母細胞を実験に用いた。初めにDilで標識したドナー細胞とmitotrackerで標識したレシピエント細胞の細胞融合によるヘテロカリオン作製条件を、ポリエチレングリコール法と電気穿孔法を用いて検討し、電気穿孔法による融合条件を確立した。ヘテロカリオンをMEF上で培養したがドナー細胞核に減数分裂を誘導できなかった。次に、レシピエント側の核の影響を除くため、サイトカラシンB処理下で遠心し脱核して得たレシピエント細胞の細胞質をドナー細胞と電気融合し、サイブリッドを作製する条件を確定した。今後はこの条件を用いて、融合後にドナー細胞の核で起こる変化を、形態的、又は減数分裂のマーカーであるSCP-1抗体を用いて免疫組織学的に検討する予定である。この実験により、non competent精原細胞に減数分裂が誘導されればcompetent精原細胞及び、精母細胞の細胞質に減数分裂誘導因子が含まれていることが明らかとなると期待される。
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