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オオムギ高親和性硝酸輸送系は、HvNRT2とHvNAR2の2つの異なるタンパク質で構成される2成分輸送系である。本研究では、HvNRT2とHvNAR2の相互作用に関し、以下の結果を得た。
1.HvNRT2/HvNAR2複合体形成のブルーネィティブ電気泳動法による解析
ブルーネィティブ(BN)電気泳動法は、複合体を形成する膜タンパク質を複合体のままで分離することのできる方法である。オオムギ幼植物根から水性2層分配法により細胞膜画分を調製し、界面活性剤で膜画分から可溶化したタンパク質をBN電気泳動に供したのち、HvNRT2およびHvNAR2を免疫プロッティング法で検出した。2つの抗体によって検出されたバンドは、それぞれのタンパク質の単量体の分子量サイズより大きく、HvNRT2とHvNAR2が細胞膜上で複合体を形成することが示唆された。
2.組換えタシパク質を用いたNRT2とNAR2の相互作用解析
HvNRT2とHvNAR2が相互作用するのかを明らかにするため、HvNRT2とHvNAR2の部分配列を大腸菌内で発現させ、それらの間の相互作用を解析した。まず、HvNRT2のC末端領域77残基(HvNRT2C)とHvNAR2の中央部分63残基(HvNAR2Cent)の組換えタンパク質断片を得、HvNRT2Cをカラムに固定化した。そのHvNRT2C固定化カラムにHvNAR2.3Centをアプライした後、カラムに結合したタンパク質を酸性溶液で溶出した結果、溶出液中にHvNAR2.3Centが検出された。このことから、HvNRT2.1とHvNAR2.3の直接的な結合が示唆された。
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