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cGMPおよびNOの植物細胞内シグナル伝達における機能、特に、cGMPの合成酵素および標的タンパク質、および最終的に転写因子の活性化に至る経路など、cGMP/NOが関与するシグナル伝達と遺伝子発現調節の分子機構は未解明である。今年度は以下の研究を実施した。
(1)強いNO応答性を確認したシロイヌナズナのニコチアナミン合成酵素(NAS)遺伝子プロモーター中の転写開始点をプライマー伸張法で決定した。NOシグナル伝達のシロイヌナズナ変異株を単離するために、NASプロモーターとホタルルシフェラーゼの融合遺伝子を作成したが、決定した転写開始点が誤っていることが判明したために、現在転写開始点を再度決定中である。
(2)T-87細胞のプロトプラストにPEG法でNASとβ-グルクロニダーゼ(GUS)融合遺伝子を導入し、GUSの発現がSNP(NO発生剤)及び8-Br-cGMP添加により誘導されることを認めた。さらに種々の長さに5'末端を欠失したプロモーターの解析によりcGMPおよびNO応答に関わるシスエレメントを絞り込んだ。
(3)グアニル酸シクラーゼおよびcGMP依存性プロテインキナーゼの植物ホモログ遺伝子を大腸菌で発現・精製し、酵素の特性を詳細に解析したが、いずれも活性は検出されなかった。
(4)ダイズSB-P細胞のプロトプラストに暗所下PEG法で遺伝子を導入する一過的発現系を確立し、NO/cGMP依存的遺伝子発現調節機構の解析を行う準備ができた。
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